研究背景:随着经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)的日益发展、推广和胸痛中心的完善建立,我国对于心肌梗死(myocardial infarction,MI)患者的血管再通率、救治成功率逐年增高,但仍有相当数量的患者发生梗死后心室重塑(ventricular remodeling,VR),严重者甚至进展为心力衰竭(heart failure,HF),尽管当前MI的治疗已从早期仅解决大血管斑块阻塞转变为同时关注如何缓解或逆转心室重塑的新策略,深入阐明MI后心室重塑发生的机制不仅可以为选择适当的治疗手段提供依据,还可以为延缓心梗后患者向心力衰竭的进程进展的药物治疗提供新靶点,具有关键临床意义。随着VR进展,梗死组织丧失心肌细胞逐渐被纤维瘢痕组织所取代。MI后,心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)在炎症及趋化因子、缺氧应激、剪切应力改变等病理因素刺激下激活表型转换功能,转变为肌成纤维细胞(myofibroblast,myoFb),激活的肌成纤维细胞增殖、迁移及分泌细胞因子和合成细胞外基质的能力增强,进而加剧心脏纤维化,导致心室顺应性受损、心脏舒缩功能下降,最终可导致心力衰竭。因此,深入理解CFs的增殖和分化过程可为减少病理性心肌纤维化提供潜在干预靶点。MI后的免疫细胞介导的炎症免疫与CFs的细胞交互作用介导VR的纤维化过程中发挥重要作用,而细胞外囊泡作为细胞间交互的重要载体是否参与对于CFs的表型转换功能及具体机制尚不清楚,本实验研究通过二代测序技术筛选出M2巨噬细胞源细胞外囊泡特异高表达分子CircUbe3a并探讨其潜在的促纤维化作用机制。第一部分M2型巨噬细胞分泌细胞外囊泡介导急性心肌梗死后心脏纤维化目的:1、培养实验所需的心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)和不同极化状态的巨噬细胞M0、M1、M2,然后利用不同极化状态的巨噬细胞与CFs共培养,研究不同极化状态的巨噬细胞对CFs的增殖迁移、表型转换等生物学行为的影响。2、抽提并鉴定M2型巨噬细胞不同粒径范围的细胞外囊泡,观察其对CFs的增殖迁移、向肌成纤维细胞分化能力的影响。3、通过构建小鼠急性心肌梗死模型,观察M2型巨噬细胞源性外泌体对急性心梗后心脏纤维化的影响。方法:1、M0、M1、M2型巨噬细胞培养及鉴定:分离小鼠骨髓单核细胞,予以30ng/mL GM-CSF刺激诱导为M0型巨噬细胞,采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测其表面标志物验证诱导效率,再分别采用20ng/mL TNF-α、100ng/mL LPS,20ng/mL IL-4进一步诱导为M1、M2型巨噬细胞,通过qRT-PCR、免疫荧光(immunofluorescence,IF)和扫描电镜进行鉴定。2、CFs的鉴定与培养:采用酶消化法联合差速贴壁培养CFs,IF鉴定其标志物盘状结构域受体2(Discoidin domain receptor2,DDR2)和波形蛋白(Vimentin)表达水平。3、建立巨噬细胞与CFs共培养体系,将各型巨噬细胞与CFs共培养48小时后,EdU染色检测CFs的增殖能力、细胞迁移实验检测其迁移能力、IF和酶联免疫吸附实验(ELISA)观察其表型转换情况即Ⅰ和Ⅲ型胶原分泌能力、α-SMA蛋白表达水平。4、细胞外囊泡提取与鉴定:采用超速差速离心法提取M2型巨噬细胞不同粒径细胞外囊泡,通过纳米颗粒示踪技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)检测各组分细胞外囊泡粒径大小,透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察其形态。5、将不同粒径细胞外囊泡与CFs共培养48小时,EdU染色、细胞迁移实验、IF分别观察其对CFs增殖、迁移、表型转换情况。6、结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心梗模型,心梗后7天经心脏原位注射exosomes,28天后取材;心脏组织予石蜡包埋,Masson染色、HE染色观察纤维化情况;提取心脏组织蛋白,Western Blot检测各组纤维化相关蛋白水平表达水平。结果:1、体外分离小鼠骨髓单核细胞,经相应细胞因子刺激可成功分化为巨噬细胞M0,流式细胞术鉴定其表面标志分子:刺激分化巨噬细胞M0高表达F4/80和CD11b,低表达CD11c,符合巨噬细胞表型。M0型再经相关因子诱导可极化为M1、M2型,IF和qRT-PCR鉴定M1和M2的标志分子也符合其相应表型:M1高表达iNOS、IL-1β、TNF-α,M2高表达MR、Arg。2、酶消化法联合差速贴壁法可成功培养CFs,呈梭形、多边形,IF鉴定其表面标志物DDR2和波形蛋白呈强阳性。3、M2型巨噬细胞源细胞外囊泡可促进CFs增殖、迁移、表型转换,其中以粒径30-100nm细胞外囊泡(即外泌体)效果最为显著,利用细胞外囊泡阻断剂抑制其分泌后,效应减弱。4、在心肌梗死模型中,与注射PBS对照组相比,注射M2型巨噬细胞外泌体组小鼠表现为:心肌梗死面积更大,心功能恶化及纤维重塑程度更严重,纤维化标志物(Collagen I、CollagenⅢ)及α-SMA蛋白水平表达更高。结论:1、体外分离骨髓单核细胞在相关因子刺激下可培养出巨噬细胞M0,并可成功诱导向M1型、M2型极化。;2、M2型巨噬细胞及其分泌细胞外囊泡可促进CFs增殖、迁移,诱导CFs发生表型转化,分化为胶原合成、迁移能力增强的肌成纤维细胞。;3、在小鼠心梗模型中,M2型巨噬细胞源exosomes加重小鼠心肌梗死后心肌纤维化,造成不良心室重构,恶化心功能。第二部分M2型巨噬细胞通过外泌体传递CircUbe3a调控CFs增殖迁移及表型转换目的:1、筛选、验证并鉴定M0、M1及M2型巨噬细胞外泌体中差异表达的CircRNA并分析其基本特征。2、体外实验初步探讨差异表达CircUbe3a对CFs增殖迁移及表型转换等生物学行为的影响。3、在体实验观察CircUbe3a对小鼠心梗后心室重塑的影响。方法:1、Exosomes提取鉴定:超速离心法联合碘克沙醇梯度密度离心分别提取各型巨噬细胞exosomes,采用TEM观察exosomes形态,NTA分析exosomes群体特征,Western Blot及流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测exosomes表面标志蛋白的表达。2、构建CircRNA表达谱,筛选差异CircRNA:利用CircRNA芯片技术检测M0及M2型巨噬细胞外泌体中CircRNA表达谱,通过qRT-PCR验证表达谱结果准确性,参考CircRNA本底表达水平及表达差异倍数等条件筛选出靶CircRNA 即 CircUbe3a。3、验证CircUbe3a的CircRNA身份及成环特性:针对CircUbe3a的反向剪切位点设计背靠背引物(Divergent primer)和线性扩增引物(Convergent primer),在cDNA及gDNA中扩增,琼脂糖凝胶电泳验证其CircRNA的成环特性,一代测序技术明确其成环形式和成环序列的具体核酸位点信息,利用RNA酶R(RNase R)消化实验及放线菌素D转录抑制实验来验证其作为CircRNA的稳定性。4、CircRNA的细胞亚定位:通过细胞核质分离技术、qRT-PCR和RNA原位杂交实验(FISH,fluorescence in situ hybridization)检测CircUbe3a的细胞亚定位情况。5、研究CircUbe3a调控CFs的生物学功能:通过慢病毒表达系统分别构建CircUbe3a的干扰、过表达CFs细胞系及其相对应的CircUbe3a的干扰、过表达M2巨噬细胞源exosomes;运用EdU染色、PI染色检测细胞周期实验观察CircUbe3a对CFs增殖能力影响,细胞迁移实验观察其对CFs迁移能力影响,Western Blot观察其对CFs表型转换情况影响。6、研究CircUbe3a对急性心梗后心脏纤维化的影响:构建具有心脏特异性表达重组9型腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9),利用其携带CircUbe3a或siRNA过表达或下调心梗模型的小鼠心脏中CircUbe3a水平,观察其对心功能、纤维化程度的影响。结果:1、CircRNA高通量芯片技术发现在M0及M2型巨噬细胞exosomes中CircRNA存在表达差异,通过构建其CircRNAs表达谱,经qRT-PCR验证,挑选出特异高表达于M2型巨噬细胞exosomes的CircUbe3a进一步研究。2、CircUbe3a的Divergent primer只在cDNA中有扩增结果,而Convergent primer在两者中均有扩增产物,说明在基因组中不存在与其序列相类似的环状DNA分子。3、经RNase R消化处理后,来源于Ube3a的mRNA表达水平明显降低,而来源于Ube3a的CircRNA即CircUbe3a的表达水平降低不明显;经放线菌素抑制转录后CircUbe3a半衰期明显长于其同源的mRNA。4、RNA FISH实验及qRT-PCR等实验显示CircUbe3a主要定位于细胞质中。5、体外实验证明上调CFs内CircUbe3a的水平促进CFs增殖、迁移和向肌成纤维细胞表型转换;而敲减CircUbe3a的表达则会抑制其增殖、迁移和表型转换;过表达和敲减CircUbe3a的M2巨噬细胞源exosomes有同样的效应。6、在小鼠心梗模型中,上调和下调其心脏的CircUbe3a水平分别促进与抑制了心脏纤维化及不良心脏重塑。结论:1、CircUbe3a是特异高表达于M2型巨噬细胞exosomes中的CircRNA。2、M2巨噬细胞通过exosomes传递CircUbe3a至CFs并促进其增殖、迁移和向肌成纤维细胞转换。第三部分M2-exosomal CircUbe3a在急性心梗后心脏纤维化中作用机制分析目的:探索M2-exosomal CircUbe3a促进CFs增殖、迁移、向肌成纤维细胞转换的作用机制。方法:1、联合使用TargetScan和miRanda等生物信息学软件预测CircUbe3a可能结合的miRNA,通过双荧光素酶基因报告实验验证CircUbe3a调节的靶miRNA,使用CirRNA Pull-down实验确定预测的miRNA是否与CircUbe3a发生相互作用,RNA FISH观察CircUbe3a和miR-138-5p在亚细胞水平的定位是否一致。2、构建miR-138-5p模拟物或抑制剂处理CFs后,通过PI染色检测细胞周期实验观察其对细胞增殖的影响,细胞迁移实验检测其对CFs迁移能力的影响,用Western Blot研究其对CFs表型转换的影响。3、将CircUbe3a过表达载体与miR-138-5p模拟物或抑制剂共同转染小鼠CFs后,用Western Blot实验检测两者的相互作用是否有功能。4、使用TargetScan,Pictar和miRanda等生物信息学软件分析预测miR-138-5p可能的下游靶基因,并通过双荧光素酶基因报告实验和Western Blot验证靶基因的表达情况。5、对筛选出的miR-138-5p靶基因RhoC构建过表达和干扰载体,通过PI染色检测细胞周期、细胞迁移实验和Western Blot分别观察过表达和干扰RhoC水平对CFs的增殖、迁移、表型转换等生物学行为的影响。结果:1、miR-138-5p是CircUbe3a的靶向结合分子,miR-138-5p显著影响CircUbe3a的荧光素酶活性,miR-138-5p和CircUbe3a在亚细胞定位一致,两者均定位于胞浆内。2、RhoC为miR-138-5p的负向调控靶基因,过表达或者抑制miR-138-5p可以使RhoC的表达水平减低或者增高。3、过表达CircUbe3a可以影响RhoC蛋白水平,但这种效应可以被miR-138-5p模拟物部分逆转。4、miR-138-5p模拟物则可以部分逆转由于CircUbe3a过表达导致的促纤维化作用。结论:CircUbe3a是M2-Exo中发挥促纤维化作用的关键成分,其主要是通过吸附miR-138-5p来保护RhoC不受降解,从而上调RhoC,起到促进CFs增殖迁移、表型转换等作用。