蛋白质组学可以动态、整体、定量的研究蛋白质的选择性表达和翻译后修饰情况，由此获得与调控网络，细胞生理生化过程以及疾病的相关信息。胚胎发育是当今生命科学研究的热点之一。在分子水平上看，胚胎发育是特定的蛋白质在特定的时间与空间表达并执行其功能。金鱼和斑马鱼以其多方面的优势受到越来越多的重视，并成为研究胚胎发育的理想系统。目前应用各种分子遗传和基因工程技术在基因水平上对金鱼和斑马鱼胚胎发育的机制已积累了一定的知识，但主要集中于对单个因子的分析。在基因组整体水平上全面了解基因的选择性表达和调控网络还有很长的路要走。本论文旨在通过对不同倍性，不同表型的金鱼进行了比较蛋白质组学分析来筛选并鉴定参与眼睛空间模式形成或胚层特化和分化相关的侯选蛋白质群。另外，还对单个斑马鱼胚胎蛋白质组学研究进行了方法学上的摸索，为进一步开展鱼类的功能蛋白质组学奠定方法学的基础。　　 罗琛等研究金鱼雌核发育单倍体发育表型，发现在单倍体胚胎发育过程中出现了正常眼，泡状眼，无腔眼三种眼睛表型。统计结果显示单倍体正常眼，泡状眼，无腔眼胚胎数目的比率为1:2:1，呈孟德尔式遗传。这说明金鱼眼睛的空间模式形成的控制至少与两个基因有关，且在单套染色体上只有50％的表达概率。本文工作首先分别提取金鱼单倍体正常眼和无腔眼胚胎的蛋白质，采用二维凝胶电泳进行分离。银染后，PDQuest2-D软件分析发现66个蛋白点在二维电泳凝胶上有显著差异。首先通过MALDI-TOF/TOF MS/MS质谱分析结合MASCOT搜库鉴定了46个差异蛋白质点。再采用优化的SPITC衍生de novo测序结合MS blast同源性搜索使得另外20个差异蛋白质点得到了准确的鉴定。鉴定到的蛋白质中包括一些重要的酶类和调节蛋白质。对其中四个差异蛋白质进行免疫印迹分析，其结果与二维凝胶电泳的一致。在无腔眼胚胎中Sonic hedgehog表达上调，Cyclophilin-type PPIase，Nm23和CDC48表达下调。免疫组织化方法分析了Sonic hedgehog，Nm23和CDC48蛋白在正常眼和无腔眼中的表达模式差异。其中，Nm23和CDC48是首次被报导在眼睛表达，且与眼睛不正常表型相关，可作为与眼睛空间模式形成相关的候选蛋白质进一步来研究眼睛发育调控的分子机制。　　 前期已发表的工作表明，在金鱼雌核发育眼睛形成时期单倍体上一些与眼睛发育、神经发育及发育调控相关的重要蛋白质未能被选择性表达，从而导致单倍体发育畸形，而具有相同基因组的二倍体胚胎发育正常。为进一步研究在金鱼雌核发育过程中不同发育阶段的单倍体和二倍体蛋白质表达水平的差异，本工作首先提取金鱼雌核发育单倍体和正常二倍体受精后18个小时的胚胎全蛋白。采用二维凝胶电泳进行蛋白质点的分离。LC-ESI MS/MS质谱准确鉴定了43个差异蛋白质点，除了分子伴侣、细胞骨架蛋白和酶类，大量卵黄蛋白质被鉴定到。卵黄蛋白为胚胎发育提供必要的营养物质和能量，在早期胚胎中具有很高的丰度。而大部分参与发育调控的蛋白质，例如重要转录因子和信号蛋白，可能由于丰度过低无法在二维凝胶上展示出来。为了减少卵黄蛋白的影响，富集低丰度蛋白质，本文工作又提取了单倍体和二倍体胚胎的核蛋白质，并采用2D-DIGE对蛋白质点进行分离。LC-ESI MS/MS质谱鉴定了66个差异蛋白质。功能分析发现大部分蛋白质与发育调控、神经发育、细胞分化、信号传导相关。由于核蛋白在胚胎早期发育中的重要性，推测这些差异表达可能导致单倍体发育不正常。这部分研究也提示单倍体与二倍体金鱼是在基因组整体小平上研究基因选择性表达及其调控机制的合适的研究系统。　　 Vsx1最先在金鱼成体视网膜中发现，已有的研究表明其在神经视网膜双极细胞的增殖、分化和正常生理功能维持中有重要作用。但vsx1在眼睛发育之外的发育调节功能研究尚无报道。罗琛等人的工作证明vsx1在单倍体胚胎中没有表达，在二倍体胚胎发育到原肠晚期和体节出现期开始有表达，这提示该基因在胚胎发育早期可能具有重要的调节功能。本工作通过反义寡核苷酸技术抑制金鱼vsx1的功能使胚胎发育停止在原肠期，提示vsx1是一个多功能分子，它在胚胎发育早期的主要功能之一可能是参与胚层特化和分化。进一步通过比较蛋白质组学分析vsx1功能抑制组和对照组胚胎的蛋白质组变化，来筛选与vsx1有密切关系的蛋白质群。LC-ESI MS/MS质谱鉴定了84个差异蛋白质，其中约81％的蛋白质仅在注射ATG-MO的胚胎中有表达或者表达上调，只有19％的蛋白质仅在对照组胚胎中表达或表达上调。功能分析显示与转录调控，细胞周期调节和组织分化相关的蛋白质，如Prohibitin2，Zinc finger transcription factor detour，BMPtype II a receptor等，都只在注射ATG-MO的胚胎中有表达或表达上调。这与先前文献报道的vsx1是一个转录抑制因子相符，表明vsx1有可能是通过这些重要蛋白质来间接调控各功能基因的表达的。本工作还鉴定到与信号传导、细胞分化、神经发育相关的蛋白质，可能直接或间接地受到vsx1的调控。　　 斑马鱼是目前一种广泛使用的强有力的模式系统，用以研究脊椎动物胚胎发生和器官发育。随着斑马鱼基因组测序工作的完成和大量关于不同发育阶段，不同生理病理条件下基因表达谱的研究，许多在胚胎发育中有潜在功能的基因被鉴定和注释。然而，目前大规模的斑马鱼的蛋白质组学研究非常有限。本工作通过shotgun蛋白质组学的分析策略，从受精后72小时和120小时的斑马鱼单胚胎样品分别鉴定到了509和210个蛋白质，假阳性率小于1％。通过比较了三种溶液辅助酶解方法，即尿素辅助法，SDC辅助法和过甲酸辅助法发现95％的胚胎蛋白质可以通过结合SDC和尿素两种辅助酶解法检测到。这表明相比于过甲酸辅助法，SDC和尿素辅助酶解法对斑马鱼单胚胎蛋白质的鉴定更有效。且1％SDC比0.5％SDC辅助酶解法更有利于对蛋白质的酶解鉴定。此外，还发现去卵黄处理对基于质谱的斑马鱼蛋白质组学分析同样重要。本研究首次报道了受精后72小时和120小时的斑马鱼单胚胎的蛋白质组，这些数据为进一步开展斑马鱼功能蛋白质组学的研究提供重要平台。更重要的是，我们开发了针对单胚胎的蛋白质组学研究，提供了一种简单但强有力的途径来扩展我们对早期胚胎发育的了解。