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一、研究背景结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率和死亡率呈逐年上升趋势。转移是恶性肿瘤主要特性之一,也是导致结直肠癌患者死亡的主要原因,因此,阐明大肠癌的分子转移机制和控制转移成为当前的主要研究方向。在前期研究中,我们对3种具有不同转移潜能的大肠癌细胞系SW480(低转移),SW620(来自SW480的淋巴结转移灶),SW480/M5(具有高选择肝脏转移特征的SW480亚系)进行差异基因表达谱分析。其中作为细胞移动、侵袭主要调节因子的Formins家族成员FMNL2基因在两组不同转移特性大肠癌细胞株均上调,引起了我们的注意,被作为一个研究大肠癌侵袭、转移的新靶点。目前研究结果表明,FMNL2与大肠癌的发生和转移密切相关,可能通过影响细胞运动促进大肠癌侵袭和转移。朱曦龄博士首次探讨了FMNL2与结直肠癌侵袭、转移的关系及分子机制,发现FMNL2在结直肠癌细胞株和组织中高表达；FMNL2沉默后抑制结直肠癌细胞的体外生长、运动、侵袭及体内肝转移能力。Katoh应用生物信息学技术研究发现FMNL2mRNA在弥漫型胃癌、乳腺癌、软骨肉瘤、黑色素瘤、胶质母细胞瘤等高度恶性肿瘤中表达,并推测FMNL2可能类似DAAM1作用机制,通过Rho相关信号通路,参与肿瘤细胞极性控制、浸润、迁移和转移。Kitzing通过实验证实FMNL2为RhoC的下游靶效应子,通过介导单细胞阿米巴模式运动调控细胞移动.Li Y等进一步研究显示在大肠癌细胞系,FMNL2通过TGF-β-诱导上皮细胞间质化(EMT)和通过Smad3或联合MAPK/MEK路径参与大肠癌细胞侵袭.。FMNL2可以促进大肠癌细胞运动、侵袭和转移,但FMNL2参与细胞运动信号通路的哪个作用环节与哪些靶蛋白发生相互作用以上问题尚不清楚。本研究在此基础上,探讨FMNL2对结直肠癌细胞侵袭和转移的影响。旨在阐述FMNL2参与细胞运动信号通路的新途径,揭示FMNL2参与结直肠癌转移的新机制。二、研究目的Formins家族成员FMNL2基因作为细胞移动、侵袭主要调节因子之一,与大肠癌转移密切相关,主要通过调节细胞骨架的构建影响细胞极化、细胞粘附和运动,而FMNL2与细胞移动、粘着斑转换的关系尚不明确,因此我们分别干扰和过表达FMNL2基因共3组大肠癌细胞株,观察FMNL2表达量与大肠癌细胞的侵袭能力及与细胞内Talin、Src表达的相关性,探讨FMNL2基因在大肠癌转移的作用及对粘附斑转换的作用机制.三、实验方法1建立FMNL2干扰及过表达的细胞模型(1)设计FMNL2基因干扰片段,构建重组质粒载体pGenesil-FMNL21、 pGenesil-FMNL22质粒及鉴定(已由朱曦龄完成)。(2)细胞培养和转染大肠癌细胞株SW620由南方医科大学病理实验室提供,在37℃5%CO2条件下,培养于含5%胎牛牛血清的DMEM中,每周传代2-3次。细胞培养至对数生长期,利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒载体导入大肠癌细胞SW620中,利用G418筛选获得抗性单克隆,挑取荧光强的克隆进行扩大培养。(3) Western blot检测FMNL2蛋白表达提取总蛋白,测定蛋白浓度,吸取40μg总蛋白,加入上样buffer煮沸5min,离心后吸取25μL上样,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉37℃封闭2h,TBST洗膜后用鼠抗人FMNL2蛋白单克隆抗体(1：500),4℃孵育过夜,洗膜后分别加入鼠抗羊IgG(1：5000),室温下摇动1h,洗膜后用化学发光系统检测。(4)构建重组质粒载体pcDNA3-Flag-FMNL2-CT将商品化的FMNL2-CT过表达重组慢病毒颗粒感染结直肠癌细胞株SW480和HT29,用慢病毒空载体做对照,利用有限稀释法筛选并获得FMNL2-CT过表达的单克隆稳定细胞株,用Q-PCR和Western blot检测转染效率(该稳定株由曾元凤提供)。2侵袭实验观察FMNL2表达量与细胞侵袭能力关系；取对数生长期的SW620,SW620/FMNL2↓,SW480,SW480/FMNL2↑,HT29,HT29/FMNL2↑细胞,用无血清DMEM培养过夜。通过24孔趋化小室和ECM胶检测细胞侵袭性.结果表示为穿过ECM胶和聚碳酸酯膜的细胞数,显微镜下每个复孔随机取5个高倍镜视野计数。实验分为SW620、SW620/FMNL2↓组和SW480、SW480/FMNL2↑组,HT29、HT29/FMNL2↑组。3Western blot检测转染前后细胞Talin、Src表达情况,PP1处理前后Talin、 Src、FMNL2三种蛋白表达变化；(1)细胞培养取三个对应组人大肠癌细胞SW620,SW620/FMNL2↓; SW480,SW480/FMNL2↑; HT29, HT29/FMNL2↑;采用DMEM培养基(含10%胎牛血清),在37℃、5%C02条件下培养,取生长状态良好的细胞的培养基中加入PP1(10μmol/L),培养24小时,收集细胞.(2) Western blot检测FMNL2, Src,Talin蛋白含量收集细胞并提取蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜后,取出PVDF膜,甲醇浸泡lmin,放入5%脱脂奶粉中封闭1.5小时.加入FMNL2抗体(1：500),Src抗体(1；1000)和Talin抗体(1：5000),4℃孵育过夜,TBST洗膜8min×3次,加入二抗室温孵育1h,TBST洗膜,经化学发光自显影方法进行成像.4荧光免疫共定位检测FMNL2、Src、Talin、F-actin大肠癌细胞内定位.将生长状况良好的细胞消化接种在共聚焦皿中,吸尽共聚焦皿中的培养基,PBS洗涤5min×3次,4%多聚甲醛固定10min,PBS洗涤5min×3次,0.1%Triton-100打孔8min,PBS洗涤5min×3次,含1%BSA的PBS封闭1h,加100μL一抗稀释液(1：100)孵育,4℃冰箱过夜,PBS洗涤5min×3次,加同时加入DyLight549Conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)红色荧光二抗和DyLight488Conjugated Goat anti-Mouse IgG(H+L)绿色荧光二抗(1：100)及荧光标记的鬼笔环肽(5μg/m1)室温孵育1h,,PBS洗涤5min×3次.取DIPI200μL染核5min,PBS洗涤8min×3次,激光共聚焦显微镜观察.5统计学分析运用SPSS统计软件包进行数据分析,所有结果均以均数士标准差表示,统计学上有意义的差异以P<0.05为标准.体外侵袭实验中,取其上、下、左、右、中心5个视野,计数穿膜细胞数,用两样本t检验,用其均值代表细胞侵润数值。Western blot检验各对照组相关蛋白含量转染前后及使用PP1前后,重复3次,Image-Pro Plus6.0软件分析Western blot条带结果,采用SPSS软件进行析因分析四、结果1、重组质粒的稳定转染pGenesil-FMNL21shRNA、pGenesil-FMNL22shRNA分别转染SW620细胞,经G418筛选获得抗性单克隆。在荧光显微镜下观察,所有转染细胞均发荧光,说明稳定转染成功。2、干扰效果检测Western blot检测干扰效率,发现FMNL2基因在克隆2中表达最弱(命名为SW620/FMNL2↓),进行下一步实验。3、FMNL2对细胞侵袭能力的影响体外侵袭小室检测细胞侵袭能力,结果表示,SW620的侵润力量值为：51.20±8.04；SW620/FMNL2、↓细胞的侵润力量值为：38.00±4.95,侵袭能力低于SW620(t=3.125,P<0.05).HT29细胞的侵润力量值为：111.20±5.45,HT29/FMNL2↑细胞的侵润力量值为：130.8±7.40,(t=4.771,P<0.05)；SW480细胞的侵润力量值为：110.40±6.39；,SW480/FMNL2↑1、细胞的侵润力量值为：124.20±4.67,(t=3.903,P<0.05)过表达后侵袭能力上升.下调FMNL2表达可以抑制细胞的侵袭能力。4干扰或过表达对Src、Talin蛋白含量的影响结果显示,沉默后的SW620/FMNL2↓细胞内的Src蛋白较SW620细胞内的降低(F=73.56,P<0.01),而Talin蛋白增高(F=7.772,P<0.05)：过表达后的SW480/FMNL2↑, HT29/FMNL2↑细胞内的Src蛋白比SW480,HT29细胞内的上调(sw480F=147.567,sW480P<0.01；HT29F=147.567,HT29P<0.01),而Talin蛋白表达量降低(sw480F=1631.542,sw480P<0.01；HT29F=150.603,HT29P<0.01)。5抑制Src通道对FMNL2、Src、Talin蛋白含量的影响使用Src通道抑制剂PPl处理前后,细胞内FMNL2蛋白含量没明显变化(P>0.05),Src蛋白含量在SW480、HT29对应组中无明显变化,在SW620对应组中略下降(F=15.659,P=0.04),而Talin蛋白在加PP1后表达量在各对照组中明显减低(sw480F=540.595,sw480P<0.01；HT29F=163.816,HT29P<0.01；sw620F.=125.507,sw620P=<0.01)6免疫共定位检测FMNL2与Src、Talin、f-actin在细胞内的共定位关系.FMNL2、Src、Talin在不同形态的大肠癌细胞中分布与定位略有不同,类圆形细胞(SW480细胞),FMNL2、Src均匀的分布于胞浆、胞膜,Talin则定位于整个细胞中,而在纤维母样细胞(SW620细胞)中,FMNL2、Src、Talin则表现出在细胞两端突起聚集高表达现象,且FMN12与两者在此存在显著共定位.同时观察FMNL2与F-actin的分布与定位,在类圆形细胞(SW480细胞),FMNL2与F-actin在靠近胞膜的位置存在散在共定位,而在SW620细胞中,Fmn12与F-actin共定位细胞膜比较连续,且在集中在细胞两端突起.五、结论1FMNL2的表达量与结直肠癌细胞的侵袭能力呈正相关性。2FMNL2处于上游参与调控Src、Talin表达,并可能通过Src间接影响Talin的表达进而参与对黏附斑转换的调控.