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结核病是由结核分歧杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的慢性感染性疾病，目前仍然是威胁人类健康的主要感染性疾病之一，亦是世界上感染性疾病致死的主要病因。近年来，随着人口流动的增加、多重耐药菌株(mult-drug resistance，MDR-TB)的出现、MTB与人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus HIV)伴发感染的发生，以及传统的结核病疫苗-卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG)接种防护的自身局限性，即仅对儿童有一定保护作用，但不能有效预防成人结核杆菌的感染，导致结核病的发生率在全球呈上升趋势。 众所周知，BCG在降低儿童原发性结核、结核性脑膜炎、粟粒性肺结核的发生方面发挥了重要作用，但对成人结核病预防作用，其免疫保护效果存在显著差异（保护率0％～80％），并且艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)患者接种BCG后可引起全身播散性感染，且发病后治疗困难，病死率高，鉴于BCG的这些不足，研制新型疫苗控制结核病更为紧迫。 本实验室在前期的研究中，构建了结核杆菌Ag85A-ESAT-6(6-kDa early secretoryantigen target)融合基因与IL-21共表达的DNA疫苗，通过肌肉注射的途径免疫实验动物，显示了一定的免疫效应，但对实验动物预防结核杆菌感染的效果仍未达到或超过传统结核病疫苗-BCG。针对这一状况和当前结核疫苗研究存在的问题，本课题旨在原有的基础上，设计新型DNA疫苗，即选用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)表面修饰的Fe3O4纳米材料作为佐剂，以增强Ag85A-ESAT-6与IL-21共同表达的DNA疫苗的免疫原性，增强免疫鼠在结核杆菌攻击后的预防及正常鼠受结核菌感染后的治疗效果，以期筛选出优于BCG的结核预防和治疗性纳米佐剂增强型的DNA疫苗，并用于临床前研究，为最终研制高效价廉安全的结核疫苗奠定试验基础。 目的： 探讨聚乙烯亚胺(PEI)修饰的Fe3O4纳米颗粒负载的新型pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗的免疫效应及对免疫鼠防治结核杆菌的保护性效果。 方法： 1.首先采用PEI修饰的Fe3O4纳米颗粒作为佐剂，制备新型的pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗(Np-PAEI)并对其表征，随后检测该疫苗能否有效转染进细胞表达靶抗原Ag85A-ESAT-6和IL-21蛋白。 2.将PEI修饰的Fe3O4纳米颗粒负载的新型pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗(Np-PAEI)，与单表达结核杆菌融合靶抗原(Ag85A-ESAT-6)的pIRES-Ag85A-ESAT-6DNA疫苗(PAE)和共同表达Ag85A-ESAT-6与IL-21的pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗(PAEI)分别接种C57BL/6小鼠三次，再用结核杆菌攻击小鼠，观察新型DNA疫苗对小鼠的保护性效应。 3.通过不同的免疫学和病理学方法，分析新型Np-PAEI DNA疫苗及其不同对照组疫苗诱导小鼠产生针对结核杆菌的细胞免疫和体液免疫及免疫病理反应。 4.采用PEI修饰的Np-PAEI DNA疫苗与BCG联合采用初免-促免（序-贯）策略免疫小鼠，并观察免疫小鼠对抗结核分枝杆菌感染的保护性作用。 5.采用标准有毒株H37Rv结核杆菌以气溶胶雾化吸入方式攻击小鼠，成功复制结核病感染模型，再用PEI修饰的Np-PAEI DNA疫苗接种治疗，并与BCG免疫治疗相比较，观察新型DNA疫苗对小鼠结核杆菌感染的治疗效应。 结果： 1.PEI修饰的PAEI质粒疫苗可以被有效吸附到Fe3O4纳米颗粒表面，并在透射电镜下显示良好的形态。Zeta电位分析显示，在pH在7.2-7.4范围内，吸附了PAEI质粒疫苗的Np-PAEI的Zeta电位为36mV左右，与细胞内环境相符合。PEI修饰的Np-PAEI纳米颗粒疫苗不仅能被有效的转染进B16F10细胞内，而且该疫苗不会明显影响所转染细胞的繁殖和生长。RT-PCR和Western blotting结果提示，新型Np-PAEI DNA疫苗在细胞内可以正确的表达Ag85A-ESAT-6靶抗原以及IL-21蛋白。 2.相比较于单独的PAE DNA疫苗和PAEI DNA疫苗，PEI修饰的Np-PAEI DNA疫苗显著增强了小鼠针对结核分枝杆菌的保护效应，并且显著抑制了小鼠体内的结核分枝杆菌的生长，与不同对照疫苗组相比，差异有显著性意义(P＜0.01)。 3.在接种了不同DNA疫苗的小鼠体内都产生了针对结核分枝杆菌的免疫反应，特别是PEI修饰的Np-PAEI DNA疫苗免疫鼠，显著增强的NK细胞、脾脏细胞和CD8+T细胞的杀伤效率;IFN-γ的分泌量和对Ag85A和ESAT-6的抗体量也明显增加，与不同对照疫苗组相比，差异有显著性意义(P＜0.01)。 4.免疫病理结果显示，PEI修饰的Np-PAEI DNA疫苗免疫鼠，肺部结核结节和免疫病理损伤及脾脏转移的结核病灶与不同对照疫苗组相比，均明显降低，差异有显著性意义(P＜0.01)。 5.与BCG免疫治疗相比较，PEI修饰的Np-PAEI DNA疫苗能产生增强的小鼠抗结核杆菌感染的治疗效应，体现在肺部荷菌量减少及病理损伤减轻，小鼠体重增长相对加快。 结论： 研制的PEI修饰的Fe3O4纳米颗粒负载的pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21新型DNA疫苗，能诱发免疫鼠产生有效地免疫反应及对免疫鼠结核杆菌感染产生防治作用，且效果优于传统的结核病疫苗-BCG。