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目的(1)通过慢性束缚应激制备腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome with predominant diarrhea,IBS-D)的大鼠模型,并从大鼠体重、排便情况以及内脏敏感性等方面进行验证。(2)分离培养大鼠结肠神经元并加以鉴定,观察神经元上目的蛋白Myosin Va与相关蛋白的共定位情况。(3)对IBS-D大鼠肠神经元Myosin Va进行基因敲低并验证转染效率,经广藿香醇(patchouli alcohol,PA)给药后验证PA对Myosin Va调控相关蛋白作用的影响。(4)对iBS-D大鼠肠神经元Myosin Va进行基因过表达并验证转染效率,经PA给药后验证PA对Myosin Va调控相关蛋白作用的影响。方法(1)将14只SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠,按随机数字表法分为对照组和模型组,每组7只。模型组大鼠每日束缚2h,持续14d。观察两组大鼠在D7、D14、D21与D28的体重变化,以及在D14、D21、D28检测大鼠的腹壁回缩反射(abdominal withdrawalreflex,AWR)评分,作为评价内脏敏感性的指标,同时每周测量大鼠4h的粪便面积,分析其排便情况是否发生改变。(2)分离大鼠结肠纵行肌肌间神经丛(longitudinal muscle/myenteric plexus,LMMP)进行消化,获取细胞悬液后种植于预处理的培养皿中,观察神经元生长情况。使用神经元特异性标记物 β-Tubulin Ⅲ和 MAP-2(Microtubule-associated protein2)进行免疫荧光以鉴定神经元,并检测神经元Myosin Va与相关蛋白nNOS(neuronal nitric oxide synthase)、LC8(dynein light chain 8)、SLC17A9(solute carrier family 17,member 9)以及 VIP(vasoactive intestinal peptide)的共定位情况。(3)在成功分离、培养大鼠肠神经元的基础上,使用转染试剂siRNA产品对肠神经元Myosin Va进行基因敲低的转染,转染48h后提取各组细胞的RNA进行实时定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)法测定并筛选出转染效率最高的siRNA试剂。经高浓度PA(20uM)孵育2小时后再次进行qPCR检测及免疫荧光检测,以验证PA的效用。(4)在成功分离、培养大鼠肠神经元的基础上,使用转染试剂gRNA产品对肠神经元Myosin Va进行基因过表达的转染,转染完成后提取各组细胞的RNA进行qPCR检测并筛选出转染效率最高的gRNA试剂。经高浓度PA(20uM)孵育2小时后再次进行qPCR检测及免疫荧光检测,以验证PA的效用。结果(1)与对照组相比,模型组大鼠的体重减少,且在D21、D28,即造模停止1-2周后模型组与对照组大鼠的体重相比较有明显的差异(P<0.05);在D14时,与对照组相比,模型组大鼠在20、60、80 mmHg压力阈的AWR评分无显著性变化(P>0.05),而在40mmHg压力阈的AWR评分有明显的升高(P<0.05),而在D21时,与对照组相比,模型组大鼠在20、60mmHg压力阈的AWR评分无显著性变化(P>0.05),而在40、80mmHg压力阈的AWR评分有明显的升高(P<0.05),在D28时,与对照组相比,模型组大鼠在20 mmHg压力阈的AWR评分无显著性变化(P>0.05),而在40、60、80 mmHg压力阈的AWR评分有明显的升高(P<0.05);与对照组比较,模型组大鼠的粪便面积在D0、D7、D14均无显著性差异(P>0.05),而在D21、D28时模型组大鼠的粪便面积显著高于对照组(P<0.05)。(2)成功分离大鼠结肠神经元,从第3天开始呈典型的神经元形态生长,并在之后长出2个及2个以上的突起,形成神经纤维网络与神经节。同时免疫荧光鉴定确为神经元,Myosin Va与相关目的蛋白nNOS、LC8、SLC17A9和VIP等在大鼠肠神经元中存在明显的共定位,主要表达在胞体及轴突上,神经胶质细胞也有相应的表达。(3)经转染后,各个siRNA组的Myosin VamRNA相对表达水平均较对照组降低,并以siRNA 1的降低效率最高。转染试剂作用48小时后,qPCR检测结果发现siRNA组与对照组相比,Myosin VamRNA的相对表达水平降低,具有统计学差异(P<0.05),但在siRNA1组与PA+siRNA1组之间则并无明显的差异(P>0.05)。在Myosin Va的荧光强度检测方面,与对照组相比,siRNA 1组Myosin Va的荧光强度显著降低(P<0.05),而siRNA 1组与PA+siRNA 1组相比则无明显差异(P>0.05)。在研究PA对Myosin Va与nNOS共定位的影响时发现,与对照组比较,siRNA1组的皮尔森相关系数和曼德斯重叠系数均降低,存在显著性差异(P<0.05),而与siRNA1组相比,PA+siRNA1组的皮尔森相关系数和曼德斯重叠系数无明显差异(P>0.05);研究PA对Myosin Va与LC8共定位的影响时发现,与对照组比较,siRNA1组的皮尔森相关系数和曼德斯重叠系数均升高,但无显著性差异(P>0.05),而与siRNA1组相比,PA+siRNA1组的皮尔森相关系数和曼德斯重叠系数无明显差异(P>0.05);研究PA对Myosin Va与SLC17A9共定位的影响时发现,与对照组比较,siRNA1组的皮尔森相关系数和曼德斯重叠系数均降低,但无显著性差异(P>0.05),而与siRNA1组相比,PA+siRNA1组的皮尔森相关系数和曼德斯重叠系数无明显差异(P>0.05)。(4)经转染后,各个gRNA组的Myosin Va mRNA相对表达水平均较对照组升高,并以gRNA3的升高效率最高。qPCR检测结果发现gRNA3组同对照组相比,Myosin VamRNA的相对表达水平升高,且均有统计学差异(P<0.05),但在gRNA3组与PA+gRNA3组之间则并无明显的差异(P>0.05)。免疫荧光结果显示,与对照组相比,gRNA3组的Myosin Va荧光强度升高,有统计学差异(P<0.05),但gRNA 3组与PA+gRNA3组的比较则无统计学差异(P>0.05)。结论慢性束缚应激可以成功诱导并制备IBS-D大鼠模型,符合其排便习惯改变以及内脏高敏的特征;Myosin Va与相关目的蛋白nNOS、LC8、SLC17A9和VIP等存在明显的共定位,Myosin Va有调控神经递质释放与转运的作用;大鼠肠神经元的Myosin Va经基因敲低/基因过表达后,PA的调节作用不显著,说明PA对Myosin Va的调节作用可能发生于转录前或转录水平,PA对Myosin Va基因转录水平的调节是精细的微调。