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肠三叶肽TFF3是三叶肽家族中最重要的小分子多肽,又称为肠三叶因子(ITF),主要分布于肠道。它由59个氨基酸残基构成,分子量约6.7KDa,属于三叶肽家族,由于具有特殊的“三叶草”空间结构,不仅能促进肠粘膜细胞的增殖,还能与肠粘液中的糖蛋白发生结合,起到稳定肠粘液和维护肠粘液屏障的作用,因而其在肠道损害修复以及再生方面具有非常重要的意义。因此,它是一种具有重要的潜在药用价值的小蛋白分子,所以对肠三叶肽的研究并能加以有效地利用就有非常重大的意义,并为深入研究TFF3的生理和药理作用机制奠定基础。目前多采用基因工程的方法获取TFF3基因片段。有研究表明,半乳糖凝集素家族的成员之一,人类galectin-1,可以作为一个融合的合作伙伴在大肠杆菌生产可溶性肠三叶肽。因此,在本试验中,重新设计与构建表达载体pET-28a,然后插入目的基因ITF,构建新的表达质粒pET28a-TFF3。再经酶切插入原TFF3编码序列,构建pET28a—TFF3重组质粒。转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白。再用Tev酶切得到肠三叶肽TFF3。结果表明:1.猪ITF基因的克隆提取猪肠道mRNA,反转录成cDNA,设计引物扩增出IFT基因,其唯长度为180bp,编码由59个氨基酸组成的蛋白质,其分子质量约为6.49kDa。2.改造和构建表达质粒pET28a-TFF3表达质粒改造自pET-28a质粒,在其中插入扩增出galectin-1基因片段,然后在其后其后连上Tev蛋白酶酶切位点、6×His标签、多克隆位点,目的基因插入在多克隆位点中。至此重组表达质粒pET28a-TFF3构建结束。3.将重组表达质粒pET28a-ITF转化入表达菌株BL21(DE3)pLysS,诱导表达。将获得的重组质粒pET28a-ITF转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,分别用不同终浓度的IPTG和不同的诱导表达时间进行诱导,以确定蛋白表达的最佳条件。在最佳诱导条件下经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测,表达的融合蛋白分子量约为25kDa,且主要可溶形式存在。以鼠抗6×His标签单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠IgG二抗对纯化产物进行免疫印迹检测,结果在目的条带所处位置出现一条印迹,且分子量大小与目的蛋白的相同,证实该蛋白为所需要的目的蛋白ITF。4.猪ITF重组蛋白的纯化。将获得的蛋白样品用His60Ni重力柱纯化后,通过SDS-PAGE分析,出现单一目的条带,表明已纯化得到融合蛋白。5.将纯化后蛋白透析、浓缩,Tev酶酶切,Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白大小约为25.3kDa,经过Tev酶切,酶切产物用TCA、丙酮沉淀法沉淀,Tricine-SDS-PAGE电泳。电泳结束后考马斯亮蓝染胶,约在16.94kDa和8.36kDa处有目的条带。