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研究背景高血压和动脉粥样硬化(AS)是心血管领域的主要疾病也是其他相关疾病如冠心病、脑中风等的重要致病因素,其病变基础是以血管平滑肌细胞(VSMC)增生和血管内皮细胞(VEC)受损为主要特征。血管平滑肌细胞的增殖和迁移在高血压病的发展和AS的进展中起着重要的作用。AngⅡ作为肾素-血管紧张素系统的重要成分,是VSMC增殖和肥大的主要刺激因子。AngⅡ是许多心血管性疾病的重要促进因素,其中部分原因也是由于其对VSMC和VEC的作用。研究显示有多条细胞信号通路参与了AngⅡ对靶细胞的作用。血红素氧合酶(HO)是血红素分解代谢的起始酶及限速酶,到目前为止被识别的主要有三种,其中HO-1为诱导型。目前的研究提示HO-1在多种细胞的生长、分化等生理和病理过程中起着重要的作用。甲基莲心碱(Nef)是由睡莲科植物莲的成熟种子的绿色胚芽即中药莲心中提取出的一种生物碱,已有研究发现该类生物碱具有抗心律失常、抗血小板聚集、抗氧自由基等作用。然而,对其详细的分子生物学及细胞生物学机制的尚不清楚,从一定程度上限制了甲基莲心碱临床的应用。目前没有关于甲基莲心碱对VSMC和VEC增殖的影响以及对AngⅡ诱导的细胞信号通路干预作用的报道。本实验主要探讨甲基莲心碱对人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长的影响以及对其可能的作用机制作进一步的探讨。具体的研究内容：1、甲基莲心碱对HUVSMC和HUVEC增殖的影响；2、甲基莲心碱对AngⅡ诱导的HUVSMC和HUVEC生长的影响；3、分析比较在AngⅡ、甲基莲心碱作用下,细胞内HO-1、ERK1/2蛋白表达的变化。材料与方法1、培养HUVSMC和HUVEC两个细胞系,MTT法检测不同浓度的甲基莲心碱和AngⅡ对HUVSMC和HUVEC细胞增殖的作用。无血清处理细胞24小时后,分别用甲基莲心碱、ZnPP IX、PD98059等预处理细胞1小时后再与AngⅡ共同孵育细胞24小时,分别做各项相关检测。2、流式细胞技术检测各处理因素对HUVSMC和HUVEC细胞周期的作用,流式细胞技术Annexin V FITC法检测甲基莲心碱对HUVSMC细胞凋亡率的影响。3、RT-PCR检测甲基莲心碱和AngⅡ对HUVSMC p21WAF1/CIP1和CyclinD1基因表达水平的作用。4、Western Blot法检测实验各组作用于HUVSMC和HUVEC 24h后细胞HO-1、ERK1／2蛋白表达和ERK1／2磷酸化水平变化,设GAPDH为内参。5、硝酸还原酶法测定HUVEC细胞上清液中NO浓度。6、统计分析：数据均采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,结果以均数±SE表示,组间比较用单因素方差分析,多样本均数之间两两比较采用q检验,P<0.05为差异具有显著性意义。结果1、甲基莲心碱抑制AngⅡ诱导的HUVSMC增殖甲基莲心碱能在体外抑制]HUVSMC增殖,且呈浓度时间依赖性。甲基莲心碱不增加HUVSMC细胞凋亡率。甲基莲心碱可有效抑制AngⅡ诱导的HUVSMC的增殖,减少进入S期的细胞数目,使细胞阻滞在G0／G1期。甲基莲心碱(0.5-5.0μmol/L)通过抑制CyclinDl mRNA的表达、促进p21WAF1/CIP1mRNA的表达,使AngⅡ促进的细胞周期进程受阻而拮抗AngⅡ的促HUVSMC增殖作用。2、甲基莲心碱上调HUVSMC的HO-1表达和抑制ERK1／2的磷酸化甲基莲心碱可显著诱导HUVSMC的HO-1蛋白的表达,呈剂量依赖趋势。5μmol/L甲基莲心碱可显著对抗AngⅡ诱导的HO-1表达的减低,同时减弱AngⅡ诱导的ERK1／2磷酸化和细胞增殖。甲基莲心碱的这三种作用均能被HO-1特异性抑制剂ZnPP IX所抑制,此外,ZnPP IX还能进一步促进AngⅡ诱导的ERK1／2磷酸化和细胞增殖。HO-1诱导剂CoPP,则可明显减弱AngⅡ诱导的ERK1／2磷酸化和细胞增殖。ERK阻断剂PD98059可明显减弱AngⅡ对HUVSMC诱导的ERK1／2磷酸化和细胞增殖作用,并阻止ZnPP IX诱导的HUVSMC增殖和显著逆转ZnPP IX诱导ERK1／2磷酸化。3、甲基莲心碱诱导HUVEC增殖及NO的分泌不同浓度(0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L)的甲基莲心碱在作用12h、24h、48h后均可诱导HUVEC明显的增生。甲基莲心碱与HUVEC增殖指数的增加呈一定的浓度依赖趋势。ZnPP IX可部分逆转甲基莲心碱的促HUVEC增殖的作用。甲基莲心碱上调HUVEC内HO-1的表达和ERK1／2的磷酸化水平,并明显增加NO的分泌。PD98059和ZnPP IX对甲基莲心碱诱导的ERK1／2磷酸化的上调均有明显的逆转作用,而对HO-1的表达无影响。结论1、甲基莲心碱可在体外抑制HUVSMC的增殖,并通过抑制CyclinDl mRNA的表达,促进P21WAF1/CIP1mRNA的表达而抑制Angll诱导的HUVSMC增殖。2、Angll可抑制体外培养的HUVEC的生长,甲基莲心碱可诱导体外培养的HUVEC的增殖并对抗Angll的生长抑制作用。3、甲基莲心碱可通过上调HO-1的表达抑制]HUVSMC的ERK1／2磷酸化。4、甲基莲心碱可上调HUVEC的HO-1表达和ERK1／2的磷酸化。5、甲基莲心碱可对抗Angll诱导的HUVEC的NO分泌减少。