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磷对家禽钙代谢、骨骼发育及健康和产蛋性能具有重要的影响,本文针对家禽磷营养代谢调控的机制开展了研究,从日粮磷水平、维生素D水平及免疫应激三个方面进行了研究,通过分析肾脏及肠道磷转运体的表达、磷在骨骼中的沉积规律和磷代谢调控因子FGF23的表达,初步确定了蛋鸡磷代谢的调控规律。1.FGF23的生物信息学分析及其m RNA组织分布对蛋鸡FGF23 CDS测序后进行生物信息学分析,发现它是具有信号肽的分泌型蛋白。FGF23系统进化树构建表明,蛋鸡同鸟类FGF23同源性较高,其次是爬行动物,再次是哺乳类及双栖类,较远的是鱼类。在80周龄的海兰褐蛋鸡中,FGF23 m RNA在肝脏中表达量极显著高于颅骨、胫骨、股骨、髓质骨、脑、脾、肠道、心及肾脏(P<0.0001)。小鼠股骨中FGF23 m RNA表达高于肝脏100倍以上,差异极显著(P<0.0001)。这表明家禽FGF23 m RNA的组织分布跟小鼠的组织分布有极大的差别。蛋鸡胚胎期股骨FGF23 m RNA表达高于肝脏、肠道等组织。α-Klotho m RNA在肾脏中极显著高于颅骨、胫骨、股骨、髓质骨、脑、脾、十二指肠、空肠、回肠、心及脾脏(P<0.0001)。2.pc DNA3.1(+)FGF23M突变质粒的构建、体内外过表达及对磷转运体的调控将pc DNA3.1(+)FGF23M质粒转染鸡胚成纤维细胞后,FGF23 m RNA及蛋白均显著上调。将该质粒注射到小鼠体内后,肝脏中FGF23 m RNA出现过表达,肾脏cyp24a1m RNA升高,cyp27b1 m RNA降低,NPT2a、NPT2c m RNA降低。3.磷转运体在蛋鸡肠道、肾脏及骨组织中的表达NPT2a m RNA在肾脏中表达最高,差异极显著(P<0.0001),肠道及骨组织中检测不到。NPT2b m RNA在十二指肠中表达量最高,其次是空肠和回肠,骨组织表达量极低,肾脏中表达最低(P<0.0001)。SLC20A1、SLC20A2 m RNA在肾脏中的表达远高于肠道、骨组织(P<0.0001),SLC20A2在肠道及骨组织中均有较高的表达,SLC20A1 m RNA在各组织中也均表达。4.LPS诱导的免疫应激对蛋雏鸡磷代谢相关调控基因表达的影响7日龄海兰褐蛋雏鸡经颅骨皮下注射LPS或生理盐水,对照组、低剂量组、高剂量组在1d、4d分别注射0.2m L生理盐水、5mg/kg BW LPS、15mg/kg BW LPS。第二次LPS注射后5天,LPS注射组颅骨、胫骨IL-8 m RNA表达比对照组显著升高。通过HE染色发现,5mg/kg BW LPS、15mg/kg BW LPS组股骨近端干骺部骨膜上及颅骨失状缝有明显的炎性浸润,而对照组炎性浸润不明显。LPS注射后15mg/kg BW组的胫骨、颅骨的DMP1、PHEX、MEPE、FGF23 m RNA表达显著低于对照组(P<0.05),与注射的LPS成剂量依赖关系,表明DMP1、PHEX与FGF23的负调控关联不大。LPS注射后15mg/kg BW组颅骨RUNX2、OPN、osteocalcin、cathepsin K、COLLⅠm RNA的表达显著低于对照组(P<0.05),表明免疫应激抑制了骨的形成、吸收及转换相关基因的表达。注射5mg/kg BW、15mg/kg BW LPS后,肾脏NPT2a m RNA表达同对照组相比显著上调(P<0.05)。三个组中十二指肠NPT2b、SLC20A1、SLC20A2 m RNA的表达差异不显著,表明试验期内免疫应激降低FGF23 m RNA的表达,上调肾脏NPT2a m RNA的表达,可能促进磷的重吸收。5.LPS诱导的免疫应激对FGF23调控的体外试验利用冲洗骨髓腔的办法培养骨髓间充质干细胞,并向成骨细胞诱导分化。用0ng/m L、10 ng/m L、100 ng/m L、1000 ng/m L LPS处理成骨诱导的骨髓间充质干细胞24h,1000ng/m L LPS组比其他组显著上调IL-6、IL-8 m RNA的表达(P<0.05),还显著上调DMP1、VDR、FGF23 m RNA的表达(P<0.05)。体外试验表明DMP1与FGF23的表达没有负相关。LPS引起的免疫应激体内、体外试验结果不一致,可能体内还有其他复杂的机制在调控FGF23的转录。6.日粮磷补充对磷代谢相关基因表达的影响挑选24周龄产蛋率95%以上海兰褐蛋鸡36只,随机分成日粮有效磷0.41%(对照)、0.82%(高磷)、0.15%(低磷)三组,试验进行11天。试验期内采食量、产蛋率、产蛋量、蛋壳硬度、蛋壳比蛋重等均没有出现差异。高磷日粮组同对照组相比显著升高血磷(P<0.001),日粮磷水平对血钙影响不显著(P>0.05)。高磷日粮上调了骨组织中FGF23m RNA的表达,但是对肝脏中FGF23 m RNA的表达影响不显著(P>0.05)。高磷日粮升高了骨组织中FGF23 m RNA的表达,这与哺乳动物研究结果一致,但是肝组织中的FGF23 m RNA不受日粮磷的影响,表明磷对FGF23在肝脏及骨组织中的转录调控不一致。日粮磷水平引起胫骨、股骨中FGF23蛋白表达的差异不显著。低磷日粮升高了肾脏磷转运体NPT2a m RNA的表达,但对于十二指肠NPT2b、SLC20A1、SLC20A2 m RNA表达没有影响。高磷日粮升高了肾脏磷转运体SLC20A1、SLC20A2 m RNA的表达。高磷日粮显著上调了颅骨、胫骨DMP1 m RNA的表达(P<0.01),MEPE m RNA表达在三个组中差异不显著(P>0.05)。再次表明DMP1与FGF23的的表达没有负相关。高磷日粮组同对照组相比显著升高血碱性磷酸酶(P<0.001)。三个组中股骨、颅骨的RUNX2、cathepsin K m RNA差异不显著(P>0.05)。高磷日粮升高了胫骨中RUNX2的表达(P<0.05),升高了颅骨、股骨中osteocalcin m RNA的表达(P<0.05)。结果表明高磷日粮同低磷日粮相比,可能增加了骨形成。7.日粮维生素D水平对磷代谢相关调控基因表达的影响挑选55周龄产蛋率90%以上海兰褐蛋鸡36只,随机分成0 IU/kg、3000 IU/kg、30000 IU/kg维生素D三组,饲喂4周。试验期4周内,30000 IU/kg组产蛋率、产蛋量、采食量显著低于3000 IU/kg组(P<0.05),但30000 IU/kg组的蛋壳厚度、蛋壳硬度及蛋壳/蛋重均显著高于3000 IU/kg组(P<0.05),说明过高剂量的维生素D添加降低了产蛋性能,但是提高了蛋壳品质。0 IU/kg、3000 IU/kg两个组产蛋性能差异不显著(P>0.05),蛋壳硬度厚度没有出现下降,说明蛋鸡在短期内能耐受不补充维生素D的日粮。30000IU/kg组的血磷显著升高(P<0.05),三个组的血钙变化不明显(P>0.05)。30000 IU/kg组同3000 IU/kg组相比显著降低了血碱性磷酸酶(P<0.001)。不同水平维生素D的补充对胫骨、股骨SLC20A1 m RNA没有显著影响(P>0.05),30000 IU/kg组同0 IU/kg组相比,胫骨、股骨SLC20A2 m RNA的表达显著降低(P<0.05)。30000 IU/kg组显著升高了肾脏cyp24a1 m RNA、NPT2a m RNA的表达(P<0.01),但SLC20A1、SLC20A2在三个组中差异不显著(P>0.05)。三个组中十二指肠、空肠、回肠SLC20A1、SLC20A2、NPT2b m RNA表达均没有显著差异(P>0.05),说明高水平的维生素D补充没有影响肠道、肾脏SLC20A1、SLC20A2及肠道NPT2b的转录,30000IU/kg组血磷的升高与肾脏表达上调的NPT2a促进磷的吸收可能关系密切。胫骨、股骨中DMP1、PHEX m RNA在三个组中差异不显著(P>0.05),FGF23m RNA在三组的肝脏组织中差异不显著(P>0.05),但是在胫骨及股骨中有随着维生素D补充的增加而上升的趋势。30000 IU/kg组显著降低股骨COLLⅠm RNA、MEPE m RNA的表达(P<0.05),降低胫骨COLLⅠ、RUNX2 m RNA的表达,提示日粮中补充过量维生素D抑制骨组织中胶原的合成,降低骨形成关键因子RUNX2的表达,降低了血碱性磷酸酶,可能抑制骨形成。综上所述海兰褐蛋鸡FGF23 m RNA的组织分布与哺乳动物存在极大的差异,而蛋鸡肝脏FGF23 m RNA表达最丰富,其次是骨组织。蛋鸡FGF23M在小鼠体内过表达,升高肝脏中蛋鸡FGF23 m RNA的表达,降低促进磷吸收相关基因的表达。高磷日粮上调了骨组织中FGF23 m RNA的表达,降低了肾脏NPT2a m RNA的表达,降低了磷的重吸收。15mg/kg BW LPS引起的免疫应激,导致骨组织中FGF23 m RNA表达下调,这与哺乳动物中免疫应激引起FGF23 m RNA的上调不一致。试验中LPS引起的免疫应激没有影响肠道NPT2b转录。、维生素D及磷的水平都没有影响肠道SLC20A1、SLC20A2的转录,而肾脏NPT2a的转录出现了不同程度的差异,说明NPT2a更容易受到转录水平的调控。免疫应激抑制了骨的形成、吸收及转换,高磷日粮增加了骨形成,过多的维生素D补充的日粮抑制骨形成。