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第一部分：优化纳米薄膜基板和成像方法实现对肿瘤细胞的高效捕获和鉴定目的：通过优化纳米薄膜基板的制作方法和捕获过程,引入新型量子点(Quantum dots,QDs)成像技术,实现对不同肿瘤细胞系的高效率捕获和鉴定。方法：在前期基础上,制备羟基磷灰石-壳聚糖(Hydroxyapatite-chitosan, HA-CTS)纳米薄膜基板,通过改变制作过程中的烘烤时间和捕获过程中的孵育时间,来提高纳米薄膜基板对上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)阴性细胞的捕获效率。引入QDs单分子成像技术,从荧光强度、抗光漂白能力及检测灵敏度等方面,比较传统有机染料和QDs对肿瘤细胞的成像能力。结果：通过比较不同烘烤时间和孵育时间下细胞系的捕获效率证实,在90分钟烘烤时间和3小时孵育时间的条件下,纳米薄膜基板对肿瘤细胞系的捕获效率最高(EpCAM阳性细胞系的捕获效率达80%以上,EpCAM阴性细胞系的捕获效率达50%以上)。QDs分子成像与传统有机荧光染料成像对肿瘤细胞的检测能力相当,但QDs分子成像具有更强的抗光漂白能力和更高的荧光强度。结论：本研究通过优化HA-CTS纳米薄膜基板,引入新型QDs成像技术,建立了一个操作性好、稳定性强、捕获效率高的肿瘤细胞捕获和鉴定系统,为循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells, CTCs)的捕获和鉴定奠定了良好基础。第二部分：纳米薄膜基板结合量子点多分子成像技术捕获和鉴定肿瘤患者异质性循环肿瘤细胞目的：联合优化型HA-CTS纳米薄膜基板和QDs多分子成像技术,捕获和鉴定不同类型和分期肿瘤患者外周血中异质性的CTCs。方法：建立QDs多分子成像技术,并在不同细胞系中验证QDs多分子探针的成像能力。应用本研究中第一部分建立的优化型HA-CTS纳米薄膜基板,捕获肿瘤患者外周血CTCs。利用QDs多分子成像技术,同时标记上皮型CTCs标记物细胞角蛋白(Cytokeratin, CK)、间质型CTCs标记物vimentin和白细胞标记物CD45,鉴定和分析异质性CTCs。结果：QDs多分子成像技术可准确描绘不同表型肿瘤细胞系的分子表达情况。联合优化型HA-CTS纳米薄膜基板和QDs多分子成像技术的捕获和鉴定系统,可成功捕获肿瘤患者外周血中的CTCs,并证实了同时存在CK阳性、vimentin阳性及CK/vimentin均阳性的CTCs。结论：本研究成功建立的优化型HA-CTS纳米薄膜基板和QDs多分子成像相结合的技术平台,可高效捕获和鉴定肿瘤患者外周血中异质表型的CTCS。第三部分：双抗体纳米薄膜基板结合量子点多分子成像对循环肿瘤细胞和循环肿瘤干细胞的研究目的：联合双抗体优化型纳米薄膜基板和QDs多分子成像技术,构建一个新型捕获和检测系统,实现对肿瘤患者外周血中CTCs和循环肿瘤干细胞(Circulating tumor stem cells, CTSCs)的同时捕获和鉴定。方法：在优化型HA-CTS纳米薄膜基板上,同时修饰EpCAM和CD133双捕获抗体,利用免疫亲和反应和纳米表面物理吸附原理,捕获肿瘤患者外周血中的CTCs和CTSCs。采用QDs多分子成像技术,标记CK、vimentin、CD45,实现对捕获细胞的识别和表型鉴定。结果：修饰双抗体的优化型纳米薄膜基板,对EpCAM中低表达细胞系的捕获效率要显著高于修饰单抗体的捕获基板(A549:P=0.003; HeLa:P=0.001; HepG2:P=0.003)。 QDs多分子成像技术证实,32名肿瘤患者外周血中存在CK阳性、vimentin阳性和CK/vimentin均阳性的CTCs。此外,进展期(Ⅲ/Ⅳ)肿瘤中vimentin阳性及CK/vimentin均阳性CTCs的比例(68.4%,52/76;78.3%,47/60)高于早期(Ⅰ/Ⅱ)肿瘤中vimentin阳性及CK/vimentin均阳性CTCs的比例(31.6%,24/76；21.7%,13/60)。结论：基于双抗体优化型纳米薄膜基板和QDs多分子成像技术的捕获和鉴定系统,显著提高了EpCAM低表达细胞系的捕获效率,并可同时捕获和鉴定CTCs和CTSCs,为CTCs的深化研究提供了技术保障。