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背景皮肤癌是人类最常见的肿瘤之一，皮肤鳞状细胞癌（SCC）约占全部皮肤癌的20%。常规采用手术、激光、冷冻、放疗等直接去除或破坏肿瘤组织，存在组织结构破坏性大、易复发、复发后再次治疗困难等诸多限制。5-氨基酮戊酸光动力治疗（ALAPDT）是一种全新的治疗技术，通过光源、氧气和5-氨基酮戊酸(ALA)的相互作用来破坏肿瘤细胞和肿瘤组织。ALA在肿瘤细胞内转换成内源性光敏性物质原卟啉IX(PpIX)，在特定波长的照射下，PpIX使氧气转换成有活性的单态氧，单态氧氧化损伤细胞器和生物分子，导致肿瘤死亡。ALAPDT的优势在于创伤性小，治疗后不影响美观、不破坏特殊部位的结构和功能，病人耐受性好，可在同一部位重复多次治疗。但是ALAPDT的缺点是治疗深度有限，在治疗深在性侵袭性皮肤SCC时疗效还不甚理想。这主要是因为给药后ALA在深部SCC组织中的浓度低、分布不均，光动力反应的效率有限。基于ALAPDT治疗机制和存在不足，我们设想开展以下两方面研究，以提高ALAPDT治疗皮肤SCC的疗效：1．提高肿瘤细胞吸收ALA转换成原卟啉IX的能力，增强光动力反应效率；2．提高ALA在组织中的渗透深度、分布的均匀性，对肿瘤的靶向选择性。因此，本研究设想通过纳米粒药物运输系统（NDDS）来提高肿瘤细胞吸收ALA转换成原卟啉IX的能力，增强光动力反应效率从而提高疗效。NDDS指的是利用纳米粒包裹运输药物。从纳米粒的安全性出发，本研究选择聚乳酸羟基乙酸纳米粒（PLGANPs）包裹运输光敏剂ALA。希望制备出5氨基酮戊酸聚乳酸羟基乙酸纳米粒（ALAPLGANPs），通过增强光敏剂ALA的稳定性、提高SCC细胞吸收ALA的效率、提高原卟啉IX的生成量，从而提高ALA的光动力反应效率。此外，纳米粒还有EPR效应（enhancedpermeability and retention effect，EPR effect），能提高ALA对皮肤SCC组织的靶向选择性。所以，我们设想通过ALAPLGANPs的应用来提高ALAPDT治疗皮肤SCC的疗效。目的通过PLGANPs装载ALA，增强PDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。包括⑴建立ALA的微量测定方法。⑵制备ALAPLGANPs并对其进行表征。⑶评价ALAPLGANPs PDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。方法⑴ALA的检测：采用荧光胺柱前衍生化HPLC-荧光法对ALA进行检测，以荧光胺作为荧光衍生化试剂，使用C18柱，以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（30︰70）为流动相，激发波长和发射波长为398nm和480nm。⑵ALAPLGANPs的制备和表征：采用超声-复乳法制备ALA PLGANPs。超声功率：120w；超声时间：初乳40s，复乳40s；ALA浓度（w/v）：2.02%，内水相（PBS（pH5））体积：0.52ml；PLGA浓度（w/v）：7.5%，并以30%甘露醇为支架剂进行冷冻干燥。采用激光粒度分析仪测定纳米粒粒径，荧光胺衍生化HPLC-荧光法检测ALAPLGANPs的包封率、载药量、缓释。扫描电镜观察ALAPLGANPs形态，红外光谱仪测定结构，差示扫描量热仪测定物相。⑶ALAPLGANPs PDT抑制鳞癌A431细胞体外增殖：鳞癌A431细胞与含有2.7mg/ml ALA PLGA NPs (相当于0.1mMALA)无血清培养基、以及含有0.1mM ALA无血清培养基分别避光孵育4h后采用透射电镜进行细胞形态学研究。接着，鳞癌A431细胞分别与含有2.7mg/ml ALA PLGA NPs、2.7mg/mlPLGA NPs以及0mM（空白对照），0.1mM，1mM，5mM，10mM ALA的无血清培养基避光条件下共孵育，于孵育1h，2h，3h，4h，5h，6h，8h，12h，14h，16h，18h，20h，22h，24h后，测定生成的原卟啉IX荧光强度。最后，采用MTT法检测ALA PLGANPs PDT对A431细胞体外增殖的抑制作用。实验分为2.7mg/mlALA PLGA NPs PDT组，0.1mM ALA PDT组,1mM ALA PDT组，2.7mg/ml ALAPLGA NPs避光组，0.1mM ALA避光组，1mM ALA避光组，单纯红光组，以及阴性对照组。孵药24h后，采用635nm He-Ne激光器（波长635nm,8J/cm2，8.6mW/cm~2）照射，再24h后MTT法观察结果。结果⑴以荧光胺衍生化HPLC-荧光法测定ALA，ALA在0.0475～47.5g/ml浓度范围内线性关系良好。回收率为99.2％，RSD为1.46%。⑵采用超声-复乳法制得的ALAPLGANPs冻干粉平均粒径为65.6±26nm,包封率为65.8±7.2%，载药量为0.62±0.27%，6h左右释药量为80%，纳米粒大小均匀，表面光滑。ALA在PLGANPs中结构无变化，但形成了新的物相。⑶ALA PLGA NPs与鳞癌A431细胞共孵育后，大量ALAPLGANPs被鳞癌细胞吸收，且主要集中于细胞质中。ALAPLGANPs或ALA与鳞癌A431细胞敷育1-24h，产生的原卟啉IX荧光强度随时间递增。孵育6h时，2.7mg/mlALAPLGANPs（相当于0.1mMALA）生成的原卟啉IX荧光强度高于各浓度的游离ALA，与0.1mMALA相比有统计学差异（P<0.01），但与1mMALA相比无统计学差异（P>0.01）。孵育24h时，2.7mg/mlALAPLGANPs产生的原卟啉IX荧光强度大于0.1mM ALA（P <0.01），小于1mM ALA (P <0.01)。体外增殖实验结果显示0.1mM ALA、1mM ALA与2.7mg/ml ALA PLGA NPs对鳞癌A431细胞无明显的暗毒性，单纯红光对A431细胞也无明显的杀伤作用。孵育6h时2.7mg/mlALAPLGANPs PDT对A431细胞的杀伤作用明显高于0.1mM ALA（P<0.01），与1mM ALA PDT相当（P>0.01）。孵育24h，2.7mg/ml ALAPLGA NPs PDT对A431细胞的杀伤作用也明显强于0.1mM ALA PDT（P=0.006，P<0.01），但小于1mM ALA PDT。结论⑴荧光胺柱前衍生化HPLC-荧光法操作简单，能准确地对微量ALA进行测定；⑵采用优化后的超声-复乳法制备出的ALAPLGANPs粒径、形态理想，包封率、载药量可，再分散性好；⑶PLGANPs装载ALA能有效地增强ALAPDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。