岩藻聚糖硫酸酯酶产生菌的筛选、酶学性质研究及酶解产物抗氧化活性预测系统的建立

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海带是我国重要的经济藻类,因其营养价值高,具有多种生理活性,受到人们的喜爱。目前,我国海带产量居世界第一位,但海带的工业利用率仅有30%,并且整体加工水平较低,导致海带产业始终无法发展壮大。因此,对海带的生理活性成分进行深入研究,进而实现海带的高值化利用,是发展海带产业的重要途径。本文围绕海带中的活性物质岩藻聚糖硫酸酯(HDFuc)及其降解产物展开研究,鉴于低分子量HDFuc在活性应用以及结构研究方面的优势,对HDFuc进行降解进而获取低分子量的HDFuc成为重要的课题。酶法降解是最理想的方式,但是由于相应商品酶制剂的缺乏,目前无法实现对HDFuc的酶法降解。本文首先进行产酶微生物的筛选。以HDFuc为唯一碳源,从荣成海域海带中筛选出一株产酶细菌RC2,经过生理生化和16s rDNA鉴定,判断RC2为黄杆菌科的一个新成员。RC2能够稳定产生岩藻聚糖硫酸酯酶(FUCenzyme),该酶属于胞内酶。经过高效凝胶排阻色谱及薄层色谱的方法确认了RC2的产酶能力,并证实该酶能够将HDFuc降解为低分子量产物。为了提高RC2的产酶能力,对其发酵培养基及产酶条件进行优化。确定RC2产酶最优培养基配方为0.2%HDFuc、0.4%牛肉膏、用过膜海水配制;最优培养条件为25℃、pH值自然、摇床转速150rpm、250mL三角瓶装液量20%、接种量10%。在上述条件下,菌株RC2培养72h后产酶活力可达178U/mL,该酶活力高于所有已报道的有可比性的细菌。并在此基础上,对RC2进行了5L发酵罐扩大发酵试验,在25℃,搅拌速度200rpm,通气量2.0L/min的条件下,经过96h的培养后收集菌体并进行细胞破碎,可获得总酶活力110530U。随后,对FUCenzyme进行了分离纯化与酶学性质研究。胞内酶经过硫酸铵沉淀和Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化,可得到单一酶活性组分,对该组分进行SDS-PAGE检测,结果为单一条带,证明得到了纯化酶。通过分子量标准曲线计算其分子量为41.0KDa。纯化过程总的酶活力回收率为11.3%,纯化倍数为11.8倍。经酶学性质分析表明,该酶最适反应温度为50℃;热稳定性较差,仅在20℃和30℃稳定,但在4℃稳定性很好,酶活力保持一个月无显著性下降。酶的最适反应pH值为8.0;在pH8.0最稳定,其次为pH7.0。该酶必须在NaCl存在下才能够显示酶活力,最适NaCl浓度为0.4mol/L或0.6mol/L。Zn2+、K+、 Ca2+对该酶有激活作用,其中Zn2+激活作用最强;Cu2+、Hg2+、Ag+对该酶有较大抑制作用,其中Cu2+的抑制作用最强。另外,NaF和EDTA-2Na对该酶有较强的抑制作用。另外,还监测了该酶催化过程还原糖含量的变化,发现反应12h内还原糖明显上升,12h后变化较小,说明酶催化反应速率在12h以后减慢。利用纯化酶对HDFuc进行酶解,首次建立了酶解产物抗氧化活性可视化预测系统。利用三个BP网络模型分别实现了对酶解过程产物的DPPH˙清除率、˙OH清除率和O2˙-清除率的预测。经验证,三个BP网络模型的最大误差均小于10%,完全能够满足应用要求,并在Matlab平台建立了抗氧化活性可视化预测系统。进一步应用遗传算法对BP网络模型进行寻优,确定最佳酶解条件为25.2℃,酶解6.4h,加酶量22.0U/(mg HDFuc),此时酶解产物的DPPH˙、˙OH和O2˙-清除率分别为39.85±1.00%、82.08±5.74%、27.67±3.45%,还原能力为0.2348±0.0044,金属离子螯合能力达到35.64±3.01%。对HDFuc及其酶解产物进行体内抗氧化活性研究。在最优酶解条件下对HDFuc进行酶解,获得酶解产物。通过建立D-半乳糖诱导的小鼠亚急性衰老模型,评估了二者的体内抗氧化活性。结果表明二者均具有显著的抗氧化活性,酶解产物在保护小鼠血清抗氧化酶活性方面的作用要优于HDFuc。综上所述,本文成功筛选到FUCenzyme产酶细菌,并对该酶进行了分离纯化。利用该酶获得低分子量的酶解产物,首次建立了HDFuc酶解产物抗氧化活性可视化预测系统,并实现了联合遗传算法进行寻优,获得了具有最高抗氧化活性的产物。经动物实验证实,该酶解产物具有显著的抗氧化活性。本文的结果为海带岩藻聚糖硫酸酯的开发应用奠定了基础,有望促进海带的高值化利用及海带产业的发展。
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