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研究背景先天性体-肺循环分流疾病相关肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)的主要病理改变是肺小动脉管壁的重构,即肌性动脉肌层增加,无肌性动脉出现肌层及新生内膜和丛状病变的形成。其中肺动脉平滑肌细功能的紊乱,即表型改变,过度增殖、迁移和凋亡抵抗在肺血管重构过程中具有重要的作用。分泌型簇蛋白(secretory clusterin,sCLU)是一种在哺乳动物体内广泛分布的蛋白质,几乎存在于所有的组织和体液中。一般认为,sCLU是一种细胞保护性因子,具有促进细胞生长的作用。基于PAH时肺血管壁细胞过度生长的特点,我们推测sCLU可能在体-肺分流性PAH发生发展过程中的表达发生了变化并且对肺血管重构的过程具有一定的影响。我们课题组近期构建了一种新型体-肺循环分流导致的大鼠单侧高动力性PAH模型,此模型成功诱导了肺循环的高压状态和肺血管重构的典型病理改变。本研究旨在探索sCLU在体-肺分流性PAH时的表达变化和在肺血管重构中可能发挥的作用。研究目的(一)明确sCLU在体-肺分流性PAH大鼠肺组织中的表达变化及其在肺动脉中的定位情况。(二)明确sCLU对肺动脉平滑肌细胞的增殖、迁移和凋亡抵抗的影响及其发挥这些作用可能经过的信号通路。方法及结果(一)sCLU在体-肺分流性PAH大鼠中的表达变化1.sCLU在体-肺分流性PAH大鼠肺组织中的表达变化建立大鼠体-肺分流性PAH模型,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(real timepolymerase chain reaction,real time PCR)和免疫印迹(Western blot)的方法分别检测sCLU的mRNA和蛋白质水平在假手术和分流大鼠肺组织中的表达。结果显示,与假手术组相比,sCLU的mRNA和蛋白表达在分流大鼠肺组织中显著升高并具有分流时间依赖性。2. sCLU在体-肺分流性PAH大鼠血浆中的表达变化酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)的结果显示,sCLU在体-肺分流性PAH大鼠血浆中表达较假手术组显著升高,具有分流时间依赖性；Spearman相关性分析表明,大鼠血浆sCLU的水平与右室收缩压、肺动脉收缩压、肺动脉平均压以及右室肥厚指数均呈显著正相关。3. sCLU在肺动脉中的定位免疫组织化学染色的结果显示,sCLU在正常肺动脉中极少表达,而在发生了中膜增厚和内膜细胞性增生甚至闭塞等重构性变化的肺小动脉中显著表达,并且其主要定位于内膜和中膜细胞的胞浆和细胞外基质中。4.ERK1/2和Akt信号通路在体肺分流性肺组织中的变化Western blot的结果显示,ERK1/2和Akt信号通路的激活在体肺分流性肺组织中显著升高,具有分流时间依赖性。(二)sCLU对肺动脉平滑肌细胞功能的影响1. sCLU特异的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)对人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cells, HPASMCs)表达和分泌sCLU的影响Real time PCR和Western blot的结果显示,sCLU-siRNA显著降低了HPASMCs中sCLU的mRNA和蛋白表达水平：ELISA的结果显示sCLU-siRNA显著降低了sCLU分泌到细胞培养上清中的量。2. sCLU在HPASMCs中的细胞周期依赖性表达Real time PCR和ELISA的结果显示,sCLU的表达和分泌具有细胞周期依赖性,处于增殖期(S期或G2/M期)的HPASMCs-表达和分泌比处于静止期(G0/G1期)的HPASMCs较高。3. sCLU对HPASMCs增殖的影响BrdU掺入法和Ki67免疫荧光染色的结果显示,外源性sCLU可浓度、时间依赖性地促进HPASMCs的增殖；用sCLU-siRNA降低sCLU的内源性表达则降低了HPASMCs的增殖能力。4. sCLU对HPASMCs迁移的影响Transwell细胞迁移实验的结果显示,外源性sCLU浓度依赖性地促进HPASMCs的迁移；用sCLU-siRNA降低sCLU的内源性表达则降低了HPASMCs的迁移能力。5. sCLU对HPASMCs凋亡的影响AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示,外源性sCLU浓度依赖性地抑制H202诱导的HPASMCs凋亡；sCLU-siRNA处理细胞则导致了HPASMCs的自发性凋亡。6. sCLU对ERK1/2和Akt信号通路的激活作用Western blot的结果显示,外源性sCLU时间依赖性地促进HPASMCs中ERK1/2和Akt的磷酸化；用sCLU-siRNA降低sCLU的表达和分泌则减弱了p-ERK1/2和p-Akt在HPASMCs中的基础性表达。结论sCLU在体-肺分流性PAH发生发展过程中表达显著升高；sCLU可通过促进平滑肌细胞的增殖、迁移和凋亡抵抗来加速肺血管重构的进展,因此sCLU或许是治疗体-肺分流性PAH有效的靶标；此外,血浆中sCLU的水平可能是体-肺分流性PAH的潜在生物标志物。研究背景心室重构是心肌梗死后心力衰竭发生、发展的重要机制之一。心脏成纤维细胞是心脏中含量最多的细胞,它在心肌梗死后迁移到心肌坏死的区域、增殖、分泌各种细胞因子和生长因子并使细胞外基质的成分发生改变,在心室重构中发挥着重要的作用。皮肤桥蛋白(dermatopontin, DPT)是一种分泌型蛋白质,在细胞与细胞外基质的相互作用和细胞外基质的组装过程中具有重要的作用。之前有研究表明它在大鼠心肌梗死的区域表达显著升高,但是它对心脏成纤维细胞功能的影响及其在心肌梗死后心室重构中的作用尚不明确。研究目的(1)研究在缺血缺氧条件下,心肌细胞(cardiomyocytes, CMs)和心脏成纤维细胞(cardaic fibroblasts, CFs)中DPT表达水平和分泌量的变化。(2)探究DPT对心脏成纤维细胞粘附、迁移、增殖的影响,明确其在心肌梗死后心室重构中的可能作用。实验方法及结果：1. Hypoxis/SD促进CMs和CFs表达和分泌DPT在体外以低氧无血清(Hypoxia and serum deprivation, Hypoxia/SD)的条件模拟心肌梗死时的缺血缺氧微环境.Real time PCR和Western blot的结果显示,Hypoxis/SD处理可时间依赖性地促进CMs和CFs中DPT的mRNA和蛋白水平的表达。此外,ELISA的结果显示,Hypoxia/SD条件下,CMs和CFs分泌DPT到细胞培养上清中的量也显著升高。2.DPT通过整合蛋白α3β1促进CFs的粘附通过一种固相细胞粘附实验我们发现,DPT可浓度依赖性地促进CFs的粘附,并且整合蛋白α3和(或)整合蛋白β1的功能阻断抗体可抑制DPT对CFs的粘附,二者联合使用时抑制作用最强,说明整合蛋白α3β1至少是CFs表面介导DPT与其粘附的受体之一。3.DPT促进CFs的铺展鬼笔环肽和纽蛋白(vinculin)免疫荧光染色的结果显示,粘附于DPT上的CFs可铺展开,形成了由肌动蛋白形成的丝状纤维细胞骨架和包含纽蛋白的黏着斑。4.DPT通过整合蛋白α3β1促进CFs的迁移应用Transwell的方法,我们发现当DPT存在于下室时,它可浓度依赖性地诱导CFs的迁移,而当DPT与细胞同时存在于上室时,它可抑制细胞向FBS或Fn的迁移,同样也具有浓度依赖性。并且整合蛋白α3的功能阻断抗体和(或)整合蛋白p1的功能阻断抗体可抑制DPT诱导的CFs迁移和减弱DPT对FBS和Fn诱导CFs迁移的抑制作用。说明DPT可通过整合蛋白α3β1促进CFs的迁移。5.DPT对CFs的增殖没有影响我们用MTS和BrdU掺入法两种方法检测了DPT对CFs增殖的影响,结果表明,DPT对CFs的增殖没有影响,这也进一步证明了DPT促进CFs迁移细胞数目的增多不是由DPT的促增殖作用而实现的。结论缺血缺氧条件下CMs和CFs合成和分泌DPT增加；心肌梗死／缺血区域表达升高的DPT可通过整合蛋白α3β1促进CFs的粘附、铺展和迁移。因此,DPT或是通过上述机制促进心肌梗死后心室重构的发展并可能是治疗心肌梗死后过度心室重构的一个靶标。