子宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤之一,发病率仅次于乳腺癌,居女性恶性肿瘤第二位,我国是子宫颈癌高发区。大量研究发现,高危型HPV感染是子宫颈癌发生的必要条件,HPV阳性子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌p16表达较正常宫颈上皮明显升高,但其异常表达的分子机制及意义不明,本课题分别以HPV16阳性的子宫颈鳞癌Caski及HPV阴性的高分化宫颈鳞癌HCC94细胞为研究对象,对子宫颈鳞癌p16表达升高的分子机制进行了初步研究。首先设计HPV16 E6/E7特异性引物,RT-PCR扩增E6/E7基因,构建E6/E7基因过表达质粒pcDNA3.1-HPV16E67。采用脂质体法将HPV 16E6/E7基因过表达质粒及对照空质粒分别转染至HCC94细胞,实时荧光定量PCR法、Western blotting法分别检测两组HCC94细胞中E6/E7及p16^ink4a基因mRNA和蛋白表达水平。设计合成E6/E7基因特异性shRNA干扰质粒,将干扰质粒及空质粒载体经脂质体介导分别转染至caski细胞中,实时荧光定量PCR法、Western blotting法分别检测两组caski细胞中E6/E7基因沉默效率及p16^ink4a基因mRNA和蛋白表达水平。实验结果显示,在过表达E6/E7的HCC94细胞中,E6/E7及p16^ink4a基因在mRNA和蛋白水平上表达量均有明显上升;在沉默E6/E7的caski细胞中,E6/E7及p16^ink4a基因在m RNA和蛋白水平上表达量均有明显下降。进一步探究E6、E7基因单独过表达与沉默对p16^ink4a基因表达水平的影响,我们构建了E7过表达质粒,E6过表达质粒及E6、E7干扰RNA（由天一辉远公司帮助合成）。分别将E6、E7过表达质粒和空质粒载体经脂质体介导转染至HCC94细胞中,实时荧光定量PCR法分别检测三组HCC94细胞中E6、E7及p16^ink4a基因mRNA表达水平,Western blotting法分别检测三组HCC94细胞中E6、E7及p16^ink4a蛋白表达水平。分别将E6、E7特异性siRNA及负对照RNA转染至caski细胞中,实时荧光定量PCR法分别检测三组caski细胞中E6、E7及p16^ink4a基因mRNA表达水平,Western blotting法分别检测三组caski细胞中E6、E7及p16^ink4a蛋白表达水平。实验结果显示对照组及单独过表达与沉默E6基因组并未引起p16^ink4a基因在HCC94和caski细胞中表达量的改变;单独过表达及沉默E7基因组则引起了p16^ink4a基因在HCC94细胞中表达的上升及在caski细胞中表达的下降。为了进一步研究p16^ink4a基因对子宫颈鳞癌细胞系周期相关基因cyclinD1与增殖相关基因Ki67的调控,及p16^ink4a基因对细胞生长曲线的影响,我们构建了p16^ink4a基因的过表达质粒及干扰RNA。采用脂质体法将p16^ink4a基因过表达质粒及空质粒分别转染至子宫颈鳞癌细胞系HCC94中,实时荧光定量PCR法、Western blotting法分别检测两组HCC94细胞中p16^ink4a、cyclinD1及Ki67基因mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测两组HCC94细胞增殖能力变化。将p16-siRNA及负对照siRNA经脂质体介导分别转染至子宫颈鳞癌细胞系caski中,实时荧光定量PCR法、Western blotting法分别检测两组caski细胞中p16^ink4a基因沉默效率及cyclin D1、Ki67基因m RNA和蛋白表达水平,MTT法检测两组caski细胞增殖能力变化。实验结果表明过表达p16^ink4a基因可引起cyclinD1、Ki67表达水平的升高,细胞生长曲线呈上升趋势,沉默p16^ink4a基因可引起cyclin D1、Ki67表达水平的降低,细胞生长曲线呈下降趋势。在子宫颈鳞状细胞癌中p16^ink4a基因表达水平与cyclinD1及Ki67基因具有正相关性,过表达p16^ink4a促进子宫颈鳞癌细胞增殖。在本课题中我们进一步研究并阐明HPV相关性子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌中p16^ink4a基因的异常表达与病毒癌基因相关,特别是与E7基因具有明显相关性。p16^ink4a作为抑癌基因在宫颈癌中并未发挥抑癌作用,并可能通过上调cyclinD1及Ki67表达水平,促进细胞周期转换和细胞增殖,参与了从子宫颈上皮内瘤变到鳞状细胞癌这一演进过程。为进一步研究p16^ink4a基因在宫颈病变中的作用机制奠定了基础。