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[目的]泌尿道感染是临床常见病,造成泌尿道感染的大肠杆菌被称为尿道致病性大肠杆菌(UPEC)。Ⅰ型菌毛是UPEC主要毒力因子之一。本文对UPEC132编码Ⅰ型菌毛结构基因的fimA进行克隆与表达,并制备抗血清,为今后的研究工作提供帮助。[方法]1.采用甘露糖敏感血凝(MSHA)和fimA PCR进行Ⅰ型菌毛的表型和基因型检测。2.PCR扩增UPEC132 fimA全基因,采用T-A克隆fimA,进行测序。然后对其和pET32a分别用BamHⅠ和HindⅢ进行酶切,T4连接酶连接构建重组质粒pET32a-fimA。采用PCR和双酶切鉴定。3.将pET32a-fimA转入表达宿主E. coli BL21 (DE3),构建重组菌E. coli BL21 (DE3)/pET32a-fimA。重组菌经0.5mM IPTG 30℃诱导表达4h,超声裂解,离心分离上清与沉淀,分别进行SDS-PAGE分析。4.采用镍亲和层析法分离纯化E. coli BL21 (DE3)/pET32a-fimA的诱导表达产物,获得纯化的FimA重组蛋白。经透析复性后,FimA重组蛋白进行SDS-PAGE检测及分析重组蛋白的纯度和浓度。5.用FimA纯化重组蛋白免疫BALB/c(?)、鼠,制备抗血清。采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot法检测血清抗体特异性。6.以UPEC132全菌悬液作为包被抗原,以制备的FimA多克隆抗血清作为一抗,HRP标记羊抗鼠ⅠgG为二抗,建立全菌ELISA方法,进行Ⅰ型菌毛的检测。[结果]1. UPEC132 MSHA结果阴性,fimA PCR阳性,表明该菌具有Ⅰ型菌毛的编码基因,但不表达Ⅰ型菌毛。2.成功构建重组质粒pET32a-fimA,经PCR鉴定和测序分析,并与GenBank数据库中的fimA基因(注册号：1037247)进行序列比对,相似性100%。3.重组菌E. coli BL21 (DE3)/pET32a-fimA经IPTG诱导表达,菌液离心后的上清进行SDS-PAGE,显示不含FimA重组蛋白。菌液离心后的沉淀经超声裂解后离心,取沉淀进行SDS-PAGE,显示重组蛋白占菌体总蛋白的37%。4.采用镍亲和层析获得纯化的FimA重组蛋白,经SDS-PAGE和凝胶成像系统分析,纯化蛋白的分子量为39.93kD,蛋白纯度为95.6%,浓度为5.87mg/mL。5.用纯化FimA重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清, ELISA测得血清效价≥1：51200,Western blot显示为单一条带。6.全菌ELISA结果显示,待检菌株与1：400的FimA抗血清反应,阴性对照E.coli k12 p678-54、阳性对照E.coli 136和UPEC132的S/N值分别为1.12、6.27和1.34。UPEC132全菌ELISA的结果为阴性,与MSHA相一致。[结论]本论文成功地克隆了UPEC132 fimA的全基因,构建了重组菌株E. coli BL21 (DE3)/pET32a-fimA,重组蛋白的表达量为37%；获得FimA纯化蛋白,制备了多克隆抗体,具有很好的特异性；为UPEC致病性的深入研究奠定基础。