天然橡胶与石油、煤炭和钢铁并称为四大工业原料,是关系到国计民生的一种重要的战略物资。世界上99%以上的天然橡胶来自巴西橡胶树。与天然橡胶生产直接相关的乳管是分布在树干树皮中的次生乳管,由维管形成层细胞分化而来。由于这些乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,所以乳管数量是决定橡胶产量的最重要的结构成分。由于外施茉莉酸及其前体物质亚麻酸均可促进巴西橡胶树的次生乳管分化,表明巴西橡胶树次生乳管分化主要受茉莉酸信号途径调节。在模式植物拟南芥中,COI1-JAZ-MYC已被证明是茉莉酸信号途径的关键环节,而且在橡胶树中已克隆了这些环节相关的基因家族成员,但是,由于缺乏合适的实验系统,目前对茉莉酸信号途径调控橡胶树次生乳管分化的分子机制仍了解得很少。由于冠菌素(COR)是体内活性形式的茉莉酸类似物,所以本研究在采用实验形态学建立冠菌素诱导巴西橡胶树萌条次生乳管分化的实验系统基础上,采用RACE、Real-time PCR、抑制性消减杂交(SSH)和比较转录组学研究技术,探讨茉莉酸信号途径对橡胶树次生乳管分化调控的分子机制,主要研究结果如下:1、证明冠菌素(COR)可有效诱导巴西橡胶树萌条的次生乳管分化,这种诱导效应具有浓度依赖性,最低有效浓度为10 μM。2、建立了冠菌素(COR)诱导巴西橡胶树萌条次生乳管分化的实验系统,在每年的6-10月均可有效诱导萌条的次生乳管分化,该效应不受阴雨天影响,而且在不同萌条中分化次生乳管保持高度一致。3、从巴西橡胶树胶乳中克隆了 10个橡胶树的MYC转录因子家族成员的cDNA全长,编号为HblMYC6-15。生物信息学分析表明:这10个基因所编码的蛋白均含有bHLH保守结构域和核定位信号,属于MYC转录因子家族成员。4、采用Real-time PCR技术分析了研究中克隆的10个MYC成员以及本研究组曾克隆的5个MYC成员的组织特异性表达以及割胶、乙烯和茉莉酸处理对其在胶乳中表达的影响。结果表明,HblMYC1-4、HblMYC6、HblMYC7、HblMYC11、HblMYC14和HblMYC15等9个基因在胶乳中高丰度表达,但HblMYC10和HblMYC13在胶乳中表达丰度极低,HblMYCl0主要在根和树皮中表达,HblMYC13主要在树皮、花和根中表达。其他4个成员HblMYC5、HblMYC8、HblMYC9和HblMYC12在其他组织中高丰度表达,HblMYC5主要在花和外胚乳中表达,HblMYC8主要在根和树皮中表达,HblMYC9主要在树皮、根、花和叶片中表达,HblMYC12主要在花和叶片中表达。在胶乳中表达丰度高的5个成员中,HblMYC1、HblMYC3、HblMYC4和HblMYC7受割胶和茉莉酸上调表达,而HblMYC2表达下调,它们对乙烯的响应刚好相反;在胶乳中表达丰度极低的HblMYC10和HblMYC13受割胶上调,而茉莉酸和乙烯下调其表达;在胶乳中低丰度表达,但在花和外胚乳中高丰度表达的HblMYC5和HblMYC12两个成员,割胶、茉莉酸和乙烯均上调其表达,且HblMYC12对乙烯响应尤为剧烈;在胶乳中低丰度表达,但在茎和根中高丰度表达的HblMYC8、HblMYC9和HblMYC13等三个成员,只有在茉莉酸处理的8h时都上调表达;HblMYC8和HblMYC9一直受割胶抑制,到5 d时才恢复,而HblMYC 13受割胶影响,只在12 h时短暂的上调。受乙烯利刺激的影响,HblMYC8 一直在上调表达,刚好相反的是HblMYC13一直在下调表达,而HblMYC 9只在中期下调。HblMYC1、2、3、4和7等受割胶和茉莉酸处理同时上/下调表达的5个成员很可能与橡胶生物合成调控有密切联系。5、利用冠菌素(COR)诱导巴西橡胶树萌条次生乳管分化实验系统,采用Real-time PCR技术分析了 COI1-JAZ-MYC环节相关23个成员在形成层区中的表达模式。结果表明,HbCOI1、HbJAZ1-7、HblMYC1-15等23个成员均受COR上调表达。根据基因在形成层区和胶乳中的表达丰度、表达的时间点、上调表达持续时间和最大上调倍数几个指标,推测HBJAZ3、HbJAZ4和HbJAZ5等3个JAZ成员以及 HblMYC3,HblMYC7,HblMYC 10 和 HblMYC13 等 4 个 MYC 成员与COR诱导次生乳管分化有密切关系。6、构建了 COR诱导巴西橡胶树次生乳管分化的SSH文库,在正反向文库中得到287个unigenes,通过反式northern blot技术验证差异表达基因,进一步采用Real-time PCR技术分析了表达差异明显的20个基因的表达模式,发现3个Ca2+途径的3个基因(CAMTA、CDPK1、CABP)和PGA、EIF可能在乳管分化过程中起调控作用。7、对COR诱导橡胶树次生乳管分化的形成层区样品进行转录组测序,共得到50 548个unigenes,预测得到47 397个CDS。在水处理相比,在COR处理的早期样品中上调和下调表达基因分别有8646和7134个,而晚期样品中上调和下调表达基因分别有7711和12113个。这些差异表达基因主要集中在代谢途径和植物激素信号转导途径。8、发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A(TSA)可以诱导巴西橡胶树次生乳管分化,这种效应具有浓度依赖性。克隆了 7个橡胶树组蛋白去乙酰化酶基因:HbHDA1-7,以及3个组蛋白乙酰转移酶基因:HbGCN5,HbHAT1和HbHAT2。采用Real-time PCR技术分析这10个基因在COR和TSA诱导次生乳管分化过程中的基因表达,根据对COR和TSA表达模式的一致性,与乳管分化相关的是组蛋白去乙酰化酶而不是组蛋白乙酰转移酶,其中HbHDA6可能是调控乳管分化有关的组蛋白乙酰化的关键因子。本研究利用建立的冠菌素(COR)诱导巴西橡胶树萌条次生乳管分化实验系统,分析了茉莉酸信号途径关键环节COI1-JAZ-MYC相关的23个成员的表达模式,初步鉴定了一些与乳管分化相关的JAZ和MYC成员,同时通过抑制性消减杂交和比较转录组分析,获得了一大批差异表达基因,而且发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA具有诱导次生乳管分化的效应,并初步鉴定了一个与乳管分化相关的组蛋白去乙酰化酶成员。这些研究结果为阐明巴西橡胶树次生乳管分化的分子调控机制打下了良好基础。