由于恶性肿瘤发病率逐年增加,发病年龄逐渐降低以及推迟生育年龄等原因,对生育力保存的需求急剧增加。相较于卵子和胚胎冻存,卵巢组织冻存后移植能够恢复卵巢内分泌功能和生育能力,并允许多个周期受孕,是目前最有希望的女性生育力保存方法,卵巢组织冷冻保存和移植获得的婴儿诞生,是人类生殖医学的里程碑,之后,各地相继有卵巢组织移植后婴儿出生的报道,并在近两年呈指数增加,迄今为止,全世界共有约130余例婴儿由卵巢组织冷冻移植后诞生。许多学者认为卵巢组织移植可作为一种行之有效的技术应用。卵巢组织冷冻有程序化冷冻和玻璃化冷冻两种方法。程序化冷冻已在临床上用于卵子和胚胎冷冻30余年。玻璃化冷冻在卵巢组织冷冻中是否优于程序化冷冻目前尚无定论,然而其用于卵子和胚胎冷冻的优越性已经被证明。由于玻璃化冷冻具有不需要昂贵仪器、冷冻过程中无冰晶形成等优点,有光明的应用前景。在过去的十年中,许多实验研究了不同的动物模型如狗、山羊、大鼠、小鼠等卵巢组织冷冻移植情况,然而,研究结果具有较大差异,基于这些实验结果,很难估计玻璃化冷冻过程造成的卵巢组织损伤程度。除物种差异外,移植物的大小、冷冻保护剂的选择等均会对移植效果产生影响。现有的关于冷冻及移植过程中卵泡丢失率的报道结果相差悬殊,缺乏详细分析。文献报道,相较于卵巢组织冷冻复苏,卵巢组织移植过程中可能丢失的卵泡更多,其原因主要为移植物在血供重新建立前缺血缺氧,然而在卵巢移植过程中卵泡丢失的具体程度仍缺乏详尽分析。卵巢组织移植较其他生育力保存方法有不可替代的优越性,因此,有良好的临床应用前景。然而,卵巢移植过程中的大量卵泡丢失,严重制约卵巢移植技术的发展。因此,如何促进新生血管形成,及早恢复移植物血供,是移植成功的关键。猪膀胱脱细胞基质膜(Urinary Bladder Matrix,UBM)是细胞外基质膜(Extracelluar Matrix,ECM)的一种,具有完整的活体组织细胞外基质的三维超微结构,以及生长因子、糖胺聚糖、粘连蛋白等生物活性成分,其中确认与组织粘附、促结合、抗凋亡、促增殖的成分有42种,目前已在临床上用于皮肤、脂肪、肌肉等组织的修复。干细胞在缺血及损伤性疾病的治疗中应用广泛。研究表明,干细胞能够促进血管形成和组织修复。脂肪间充质干细胞来源方便、增殖力强,不具有成瘤性,使用安全。近年来,有数篇关于干细胞用于卵巢移植的研究。这些研究证实,脂肪间充质干细胞在改善卵巢移植效果方面有良好的应用前景。然而,移植后的干细胞存活率较低,这阻碍了干细胞治疗技术的推广和应用。有文献研究表明,应用合适的生物支架可以提高干细胞存活率。而UBM能促进干细胞增殖和分化,我们尝试将干细胞接种在UBM上后用于大鼠卵巢自体移植,验证应用UBM是否会增加脂肪间充质干细胞的作用,进一步改善卵巢移植效果。第一部分大鼠卵巢玻璃化冷冻及自体移植对卵巢组织的影响目的:观察大鼠卵巢玻璃化冷冻复苏及自体移植过程对卵巢组织的影响,探讨冷冻和移植操作对卵巢产生影响的作用机制。方法:SD雌性大鼠随机分为正常对照组、冷冻组、移植组,移植组大鼠将两侧卵巢组织取出,一分为二分别移植于同侧肾背膜下,冷冻组将大鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏,将各组卵巢组织石蜡切片并HE染色,观察卵泡形态并卵泡计数;采用Tunel荧光染色技术,观察细胞凋亡情况;免疫组化方法观察各组VEGF阳性面积比。结果:正常对照组、冷冻组及移植组分别计数卵泡1231、1077、575个,移植组减少明显,移植组形态异常卵泡数较正常对照组增加明显(P<0.05)。凋亡检测中,冷冻组和移植组凋亡率较正常对照组显著增加(P<0.05)。VEGF在3组卵巢组织中均有表达,但冷冻组及移植组表达较正常对照组减少,差异有统计学意义。结论:卵巢组织冷冻或自体移植过程中均伴有卵泡丢失、VEGF表达下降。提高移植卵巢组织的VEGF表达,可能对促进移植物血管形成、提高卵巢移植效率有积极作用。第二部分UBM在大鼠卵巢自体移植中的作用目的:验证UBM能促进移植卵巢新生血管形成,减少移植组织卵泡数量的丢失,改善移植效果,探讨其促进血管生成的作用机制。方法:1.8周龄SD大鼠行卵巢自体移植,根据术中处理方法不同分为5组:正常对照组、自体移植组、自体移植+UBM(UBM组)、自体移植+VEGF组(VEGF组)、去势组,其中,正常对照组用于卵泡计数比较,去势组仅用于血清激素水平比较。在自体移植后28天,行卵巢组织HE染色,观察细胞形态、卵泡计数;术后28天,ELISA测定血清FSH、AMH水平;分别于移植后7天和28天CD31染色,观察血管生成情况;自体移植后7天,Tunel及Masson染色观察凋亡和纤维化情况。2.将第3代人脐静脉内皮细胞分为对照组和UBM组,分别接种在六孔板上,UBM组预先将UBM铺在六孔板底,观察细胞增殖情况,并于接种后第1、3、5天行CCK8实验,检测细胞增殖情况;同时进行Western-blot和RT-PCR检测,探讨UBM体外促进血管生成的作用机制。3.8周龄SD大鼠行卵巢自体移植术,依据术中处理方法不同分为自体移植组和自体移植+UBM组(UBM组),卵巢自体移植后7天,微血管CT成像比较两组移植卵巢血管生成情况,取出卵巢组织,行Western-blot和RT-PCR检测,探讨UBM在体内促进血管生成的作用机制。结果:1.自体移植组、UBM组、VEGF组卵泡均较正常对照组减少,(P<0.05);UBM组原始卵泡及生长卵泡数量较单纯移植组均增加;UBM组FSH显著低于自体移植组及VEGF组(P<0.05),AMH激素水平测定结果同FSH基本一致;同单纯移植组及VEGF组相比,UBM组CD31阳性表达率显著增加(P<0.05);Tunel染色显示,与单纯移植组相比,UBM组、VEGF组凋亡细胞均减少(P<0.05),且UBM组凋亡率最低,差异有统计学意义(P<0.05);Masson染色结果:与单纯移植组相比,UBM组、VEGF组相对纤维化明显减少,且UBM组纤维化面积最小,差异有统计学意义(P<0.05)。2.CCK8实验:人脐静脉内皮细胞在UBM上增殖与对照组相比无统计学差异(P>0.05);Western-blot和RT-PCR结果提示,UBM组人脐静脉内皮细胞KDR、Notch1、Ang2表达增加;术后7天,Western-blot和RT-PCR结果提示,UBM组KDR、Notch1、Ang2表达增加。体内和体外实验均表明,UBM上调KDR、Notch1、Ang2表达,促进血管形成。结论:UBM通过上调KDR、Notch1、Ang2表达,激活血管生成信号通路,通过促进血管形成改善卵巢移植效果,值得进一步研究和推广。第三部分脂肪间充质干细胞联合UBM在大鼠卵巢自体移植中的作用目的:验证脂肪间充质干细胞能促进移植卵巢新生血管形成,改善移植效果;证明应用脂肪间充质干细胞联合UBM能进一步改善卵巢移植效果。方法:1.分离并制备大鼠脂肪间充质干细胞,经成脂、成骨实验鉴定其有多向分化的能力,通过流式细胞技术对其表面抗原进行测定。2.SD大鼠行卵巢自体移植,根据术中处理方法不同分为5组:正常对照组、自体移植组、自体移植+ADMSCs组(ADMSCs组)、自体移植+ADMSCs组+UBM组(联合组)、去势组,其中,正常对照组用于卵泡计数比较,去势组仅用于血清激素水平比较。在自体移植后28天,行卵巢组织HE染色,观察细胞形态、卵泡计数;术后28天,ELISA测定血清FSH、AMH水平;分别于移植后7天和28天CD31染色,观察血管生成情况;自体移植后7天,Masson染色观察纤维化情况。结果:1.成功制备大鼠脂肪间充质干细胞。2.同单纯移植组相比,ADMSCs组原始卵泡及生长卵泡数量均增加显著(P<0.05),联合组原始卵泡数及生长卵泡个数较ADMSCs组均增加,差异有统计学意义(P<0.05);同自体移植组相比,ADMSCs组及联合组FSH水平显著均降低(P<0.05),AMH激素水平测定结果同FSH基本一致;CD31结果提示:ADMSCs组、联合组新生血管数量均较单纯移植组增加;Masson染色结果:联合组纤维化面积较单纯移植组减少明显,差异有统计学意义。结论:应用脂肪间充质干细胞可改善卵巢移植效果,UBM可促进脂肪间充质干细胞在移植部位的附着、定植,ADMSCs联合UBM可显著增加移植卵巢组织血供。