论文部分内容阅读
骆驼是久居沙漠的大型哺乳动物,其作为动物抗逆性研究的良好生物资源拥有着极其重要的科研和应用价值。本试验对9只雌性双峰驼（Camelus bactrianus）进行了转录组测序,再通过抗性基因筛选、转录后调控分析和实验验证,为揭示骆驼适应沙漠环境的独特机制和解决人类高血压、高血糖等疾病提供了分子理论基础。本试验将9只雌性双峰驼随机分配到盐胁迫试验组、禁水胁迫试验组和自由饮食对照组中,每组3只。经24天的试验处理后分别采集9只骆驼的肾皮质、肾髓质、肝脏和回肠,利用Illumina HiSeq4000和2500测序仪,对所采集的组织样品进行测序,并从质控后的有效数据中筛选得到差异表达的mRNA和非编码RNA。与对照组相比,盐胁迫肾皮质有差异表达的mRNA 13种,lncRNA 4种,miRNA 11种;禁水胁迫肾皮质有差异表达的mRNA 14种,lncRNA 0种,miRNA 18种;盐胁迫肾髓质有差异表达的mRNA 22种,lncRNA 2种,miRNA 31种;禁水胁迫肾髓质有差异表达的mRNA 17种,lncRNA 0种,miRNA 26种;盐胁迫肝脏有差异表达的mRNA 14种,lncRNA 5种,miRNA 12种;禁水胁迫肝脏有差异表达的mRNA 16种,lncRNA 1种,miRNA 37种;盐胁迫回肠有差异表达的mRNA 22种,lncRNA 3种,miRNA 56种;禁水胁迫回肠有差异表达的mRNA 43种,lncRNA 7种,miRNA 36种。结合差异表达基因的GO富集,KEGG通路富集和文献分析,从上述差异表达基因中选取出了与盐代谢、糖代谢和水代谢相关的基因作为候选基因,包括盐胁迫肾髓质中的SLC6A1、SLC14A1、PCBP2、PEX5L、LNC003834、miRNA-34a 共 6种;禁水胁迫肾髓质中的ACLY、PCBP2、LOC105061856、miRNA-195共4种;盐胁迫肝脏中的TENM1、PKP4、CDH11、LOC105061856、miRNA-195共6种;禁水胁迫肝脏中的PLIN2、SDS、UPP2、LOC105061856、miRNA-365-3p、miRNA-128、miRNA-148a共7种;盐胁迫回肠中的AQP5 MUC6共2种;禁水胁迫回肠中的AQP5、MUC6、LOC105076960、miRNA-362-5p、、miRNA-96、miRNA-29b共6种。再通过对盐胁迫和禁水胁迫下的肾髓质、肝脏和回肠的候选基因进行qRT-PCR验证,定量结果与测序结果的差异表达趋势一致。对盐胁迫肾髓质中的候选ceRNA基因SLC14A1 LNC003834、miRNA-34a进行FISH检测和Luciferase检测,结果显示非编码的LNC003834和miRNA-34a与细胞核是异位表达的,miRNA-34a可以靶向抑制SLC14A1的mRNA,而LNC003834则通过竞争性结合miRNA-34a来降低miRNA-34a对SLC14A1表达的抑制。对候选抗氧化基因SLC6A1、PCBP2、PEX5L进行RNAi和ROS检测发现,shRNA慢病毒干扰SLC6A1、PCBP2、PEX5L成功的骆驼肾髓质细胞与正常骆驼肾髓质细胞相比,活性氧ROS表达上升。综上,进一步建立了候选基因在骆驼肾髓质、肝脏和回肠在盐胁迫和禁水胁迫下的调控模型。肾髓质通过ceRNA机制上调尿素转运蛋白B的基因表达来降低Na+重吸收进血液的量,同时上调GABA转运蛋白1、过氧化物酶体合成因子5相关蛋白和聚（rC）结合蛋白2的基因表达来增强细胞的抗氧化能力,进而达到耐高盐的目的;通过下调ATP柠檬酸合酶和血红蛋白亚基β的基因表达来降低细胞呼吸和新陈代谢,同时上调聚（rC）结合蛋白2的基因表达来增强细胞的抗氧化能力,从而起到抗干旱的作用。肝脏实现耐高盐是通过上调Teneurin跨膜蛋白1的基因表达来提高细胞基底膜的渗透屏障作用,上调钙黏蛋白-11和桥粒斑菲素蛋白 4的基因表达来增加细胞黏附并降低Na+进细胞所需的表面积,下调血红蛋白亚基β的基因表达来降低细胞呼吸和新陈代谢,下调丝氨酸脱水酶的基因表达来降低糖异生并防止细胞内糖沉积;实现耐高血糖和抗干旱是通过下调尿苷磷酸化酶2和丝氨酸脱水酶的基因表达来降低糖异生和糖原合成,上调脂滴包被蛋白-2的基因表达来促进脂滴积累和类乳脂球分泌出细胞,下调血红蛋白亚基β的基因表达来降低细胞呼吸和新陈代谢。回肠耐高盐是通过下调水通道蛋白-5的基因表达来防止因细胞外渗透压过高引起的失水,下调粘蛋白-6的基因表达来降低经Na+/Ca2+交换体的粘蛋白分泌并防止大量Na+进细胞来完成的;耐高血糖和抗干旱的实现是通过下调水通道蛋白-5的基因表达来防止细胞内水流失,下调粘蛋白-6的基因表达来降低经Na+/Ca2+交换体的粘蛋白分泌并防止Ca2+流失,其中Ca2+能促进脂肪酸合酶FAS表达和活性,上调线粒体肌酸激酶U型的基因表达来形成能量缓冲作用,从而减缓大量葡萄糖经钠依赖性葡萄糖协同转运蛋白进入细胞带来的糖负荷。