研究背景中暑(简称HS)是一种威胁生命的疾病,其定义为核心体温升高≥40℃,多并发严重的多器官功能障碍(MODS)。近年来,由于温室效应,中暑的发生率也逐年增加。在中暑早期就可出现不同程度的肝功能损害,且损害程度与中暑发生发展及预后密切相关,流行病学显示重症中暑合并肝衰竭时,患者的死亡率也会显著增加,甚至高达50%。目前,中暑致肝损伤的原因复杂,其机制尚未阐明。外泌体是由双层磷脂包围的囊泡状结构,直径30-200nm。外泌体内含物中包含了成千上万种生物活性分子,如蛋白质、脂质和核酸,其能将这些分子传递到受体细胞,导致其功能改变。肝源性外泌体在各种肝脏病理生理机制中扮演重要作用。外泌体蛋白或miRNA可作为肝病的新型生物标志物。人们对肝脏疾病中分泌的外泌体内含物进行了探索。来源细胞不同或者在不同刺激条件下,外泌体其内部组分的生成、装配、分泌方式及其功能具有很大的差异。此外,同细胞来源的外泌体对于不同靶细胞的影响亦存在不同。然而,关于肝细胞来源的外泌体在中暑肝损伤中的作用及蛋白质表达谱知之甚少。因此,研究中暑中肝细胞来源的外泌体的蛋白质谱变化及其在肝损伤中的功能作用可以提高我们对中暑发病机理的认识,并可能提供潜在的临床价值。目的本课题的研究主要通过对热应激肝细胞释放的外泌体进行蛋白质组学分析,研究其差异蛋白介导肝细胞损伤可能存在的分子机理和信号通路,为拓展中暑肝损伤机制提供新的思路,为临床干预中暑肝损伤提供新的靶点和策略。方法1、热应激刺激肝细胞后收集上清,超高速梯度离心提取外泌体。通过透射电镜、纳米粒子示踪分析(NTA)、蛋白免疫印迹(Western blot)对外泌体的一般特征进行鉴定。2、通过等重同位素多标签相对定量蛋白质组学(iTRAQ)方法分析对照组及热应激肝细胞来源两种外泌体中蛋白质的组成差异。3、对差异蛋白质进行生物信息分析:GO功能注释和KEGG聚类分析。4、通过体外直接吸收实验和体内示踪实验验证外泌体可以被肝细胞和肝脏摄取。5、进行如下分组:Ctrl、Ctrl-EXO、HS-EXO、HS、HS+GW4869。行流式细胞术检测肝细胞的凋亡与坏死性凋亡的比例;检测上清/血清ALT、AST、LDH水平评价各组肝损伤情况;免疫蛋白质印迹检测活化的Caspase-3/8和RIPK1/RIPK3/磷酸化的MLKL的表达,验证肝细胞的凋亡与坏死性凋亡;通过小鼠肝脏HE染色、TUNEL染色评价各组肝损伤情况。6、此外,选择差异最明显的蛋白TRAIL用于进一步验证。通过蛋白质印迹分析验证外泌体TRAIL水平与肝损伤程度和肝损伤严重程度是否相关。结果1、肝细胞分泌的微粒具有外泌体的特征:粒径约为100nm,单个分布,形态表现为圆形或杯口形经典的双层膜性结构。2、iTRAQ方法分析对照组及热应激肝细胞两组外泌体的差异蛋白共有74个。GO功能注释分析发现,两组外泌体的差异蛋白在体内发挥的作用不尽相同。在功能上主要分为结合功能、分子功能、催化活性、运输活动。细胞组分上面差异蛋白主要定位于细胞、细胞器部分以及细胞连接。随后我们发现GO功能富集实验中,程序性细胞死亡所占比例较高。3、通过KEGG分析,我们发现主要富集通路包括坏死性凋亡,P13K-Akt,抗原加工和呈递,细胞凋亡等。4、热应激肝细胞来源外泌体可以被肝细胞和肝脏吸收。5、热应激后肝细胞可释放大量的外泌体,引起肝损伤:HS-EXO组的肝细胞发生凋亡和坏死性凋亡的数量显著增加。而CRTL-EXO组并没有增加上述现象,且HS+GW4869组可显着降低肝细胞凋亡和坏死性凋亡的发生。6、其中在参与程序性细胞死亡的正调节的蛋白质中,TNFSF 10(TRAIL)具有最高的倍数变化。同时在蛋白质-蛋白质相互作用网络图中,我们发现TRAIL发挥了核心作用。7、蛋白质印迹证明了HS-外泌体中TRAIL的富集。结论1、热应激肝细胞可释放大量的外泌体,引起肝损伤。2、对照组及热应激肝细胞两组外泌体所携带的蛋白谱存在显著差异,并富集出程序性细胞死亡信号通路与热应激肝损伤密切相关。3、血清外泌体TRAIL可能成为热应激肝损伤的治疗靶点。