论文部分内容阅读
目的:通过体外对人羊膜间充质干细胞(human amniotic membrane mesenchymal stem cells,h AMSCs)的分离、培养及鉴定,并在体外诱导分化为雪旺氏细胞样细胞(induce Schwann cells,i SCs),分别观察两种细胞移植对皮瓣神经再生的影响。方法:1)产妇知情同意后采集足月剖宫产羊膜,采用胰蛋白酶/胶原酶二步消化法分离提取h AMSCs,接种48h后予以细胞换液以去除人羊膜上皮细胞,并按同样方法传1~2代,通过差速贴壁方法纯化h AMSCs。流式细胞术和细胞免疫荧光鉴定h AMSCs。2)取P3代生长至第6d的h AMSCs在体外诱导分化为i SCs,诱导分化后,分别取i SCs和P3代h AMSCs做免疫荧光染色检测两组细胞S-100、P75和GFAP的表达;Western blot检测两组细胞S-100、P75和GFAP蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测两组细胞S-100、P75和GFAP基因表达;ELISA检测h AMSCs培养6d以及h AMSCs诱导后1d、4d、7d、10d、13d、16d、19d上清液中BDNF和NGF浓度。3)建立大鼠腹壁失神经支配穿支皮瓣模型,分为三组:即h AMSCs移植组(A组)、i SCs移植组(B组)及穿支皮瓣模型对照组(C组),每组25只。取增殖期的P3代h AMSCs和诱导后的i SCs,分别于每只大鼠皮瓣标记处皮下多点注射1×106个相应细胞,C组注射PBS。免疫荧光染色观察神经再生,分别于细胞移植后2d、5d、7d、9d、14d各组取5只动物。结果:1)本实验中采用胰蛋白酶/胶原酶双酶化法可以获得大量增殖稳定的h AMSCs,并利用差速贴壁法可去除大量的人羊膜上皮细胞,获得纯度较高的h AMSCs。h AMSCs原代培养48h后可见细胞贴壁生长,5~6d细胞密度可达到80%~90%。流式细胞鉴定:CD90(99.61%)、CD44(99.64%)、CD73(99.82%)、CD105(91.84%)呈阳性,CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR呈阴性(0.12%)。细胞免疫荧光染色结果显示h AMSCs高表达波形蛋白,未表达CK19。2)免疫荧光染色结果显示i SCs组S-100、P75和GFAP的表达量明显高于h AMSCs组(P<0.05);Western blot结果显示i SCs组S-100、P75和GFAP蛋白表达量明显高于h AMSCs组(P<0.05);q PCR结果显示i SCs组S-100、P75和GFAP的基因表达量明显高于h AMSCs组(P<0.05);ELISA分别检测h AMSCs培养6d以及h AMSCs诱导后1d、4d、7d、10d、13d、16d、19d上清液中BDNF和NGF浓度:可见h AMSCs培养6天后BDNF和NGF均有表达,加入诱导液1后,BDNF和NGF表达量明显降低,随着诱导液2及诱导液3的依次添加,BDNF和NGF的表达量逐渐升高,且浓度明显高于h AMSCs培养6d组,说明在诱导分化过程中分泌了大量的BDNF和NGF,提供了潜在的促进神经再生的营养支持。3)细胞移植后第2d、5d、7d、9d、14d分别行皮瓣组织免疫荧光染色,i SCs移植组再生神经纤维数量和直径均高于h AMSCs移植组。结论:1)胰蛋白酶/胶原酶双酶消化法可获得大量的hAMSCs,通过胰酶消化和差速贴壁法,可获得高纯度的h AMSCs;2)分别通过免疫荧光、Western blot、q PCR及ELISA等方法的鉴定,证明了h AMSCs在体外经过适当的化学因子调节后可诱导分化为雪旺氏细胞样细胞,且在诱导分化过程中释放了大量的促进神经生长的因子;3)h AMSCs和i SCs分别移植到失神经支配的皮瓣模型后均可观察到神经的再生,i SCs通过释放大量的BDNF和NGF,在神经再生数量和直径方面均高于h AMSCs。