【摘 要】
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山羊奶具有极高的营养价值,含有人体所需的蛋白质、碳水化合物、多种维生素和微量元素等物质。乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）作为羊奶中的一种重要成分,具有多种生物学功能,例如抗菌、抗炎、抗氧化等作用,能够对机体进行免疫调节。本试验基于转染乳铁蛋白过表达质粒的奶山羊乳腺上皮细胞（GMECs）,使用高通量测序技术从而分析得到差异表达的mi RNA,利用靶基因预测网址来预测靶基因,选择与免疫调节相关
【基金项目】
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陕西省创新能力支撑计划项目（编号:2021TD-31）； 国家自然科学基金项目（编号:31672398）；
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山羊奶具有极高的营养价值,含有人体所需的蛋白质、碳水化合物、多种维生素和微量元素等物质。乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）作为羊奶中的一种重要成分,具有多种生物学功能,例如抗菌、抗炎、抗氧化等作用,能够对机体进行免疫调节。本试验基于转染乳铁蛋白过表达质粒的奶山羊乳腺上皮细胞（GMECs）,使用高通量测序技术从而分析得到差异表达的mi RNA,利用靶基因预测网址来预测靶基因,选择与免疫调节相关的mi R-224-5p和靶基因去整合素和金属蛋白酶17（A Disintegrin and Metalloprotease17,ADAM17）,探讨其对GMECs免疫调节的影响,希望可以增加免疫力,为研究山羊机体的免疫调节提供一定的理论依据。获得的主要结果如下:1、与pc DNA3.1组相比,LF过表达组共鉴别出22个差异mi RNA,其中有15个上调的mi RNA,7个下调的mi RNA,其中chi-mi R-224-5p显著上调;通过在线网络预测到mi R-224-5p与ADAM17的3’UTR具有结合位点;荧光定量PCR检测发现,转染mi R-224-5p mimic后ADAM17的m RNA表达量显著降低,转染mi R-224-5p inhibitor后ADAM17的m RNA表达量极显著增加（P＜0.01）;检测发现,mi R-224-5p mimic可以显著降低TNF-α和IL-8的m RNA表达量（P＜0.05）,mi R-224-5p inhibitor极显著增加TNF-α、IL-6和IL-8的m RNA表达量（P＜0.01）。2、根据Gen Bank中山羊的ADAM17基因预测序列设计引物,克隆得到山羊ADAM17基因的CDS序列。序列长度为2478 bp,编码825个氨基酸,蛋白分子量为92.92 KDa。同源性分析结果显示,奶山羊ADAM17与绵羊和牛亲缘关系最近,同源性分别为99.15%和97.14%,与大鼠和小鼠亲缘关系最远,同源性分别为85.13%和85.25%。3.通过在GMECs中转染pc DNA-ADAM17载体,发现TNF-α、IL-6、IL-8等炎症相关细胞因子的表达水平极显著增加（P＜0.01）;转染si-ADAM17能极显著降低TNF-α、IL-6和IL-8的m RNA的表达水平（P＜0.01）;转染mi R-224-5p inhibitor及si RNA-NC的乳腺上皮细胞中ADAM17和TNF-α的m RNA表达量极显著增加（P＜0.01）,IL-6和IL-8的m RNA表达量显著增加（P＜0.05）;转染mi R-224-5p inhibitor及si RNAADAM17的GMECs中ADAM17、TNF-α、IL-6和IL-8的m RNA表达量均极显著降低（P＜0.01）。综上所述,在过表达LF的奶山羊乳腺上皮细胞中筛选得到了表达升高的mi R-224-5p,成功克隆得到靶基因ADAM17的CDS区,进一步发现mi R-224-5p能够通过其靶基因ADAM17调节炎症相关细胞因子,为解析奶山羊免疫调节机制奠定了重要的理论基础。
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