研究背景:急性心肌梗死是导致心血管疾病患者死亡的重要原因。近几十年来,随着冠状动脉介入治疗及药物治疗的进展,急性心肌梗死患者的死亡率已明显下降。然而,由于大量心肌细胞死亡和心肌细胞的不可再生性,心肌梗死继发心力衰竭的患者明显增多,严重降低心肌梗死患者的生活质量。如何进一步减少心肌细胞的死亡,保留更多的工作心肌,是避免心肌梗死继发心力衰竭的重要手段。越来越多的研究发现了环境因素在疾病发生发展中的作用。吸烟、高脂饮食、高糖饮食等环境因素可在不改变基因序列的前提下,调控基因的表达参与心血管疾病的发生发展,这也就是所说的表观遗传学。大量研究证实,通过调控表观遗传学修饰可改善心肌梗死的预后,并有望成为治疗心肌梗死的新策略。作为真核生物最广泛存在的一种表观遗传学修饰方式,m6A甲基化已成为近些年研究的热点。m6A甲基化是在METTL3等甲基化转移酶的作用下,将RNA腺嘌呤第6位N原子上的氢键转换为甲基,完成m6A甲基化修饰。去甲基化酶ALKBH5和FTO可移除RNA m6A甲基化。近期研究发现,在小鼠心肌梗死和缺氧诱导的H9c2细胞损伤模型中,RNA的m6A甲基化修饰水平明显升高,提示RNA m6A甲基化在急性心肌梗死的过程中可能发挥了重要作用。然而,急性心肌梗死上调RNA m6A甲基化修饰的机制并不清楚。FTO是首个被发现的RNA m6A去甲基化酶。作为一种双加氧酶,在氧气等底物的参与下,FTO蛋白能够氧化单链DNA或单链RNA的甲基使其去甲基化。缺氧时由于底物的匮乏,FTO的去甲基化能力会严重下降。研究发现,通过调控RNA的m6A甲基化水平,FTO可稳定心脏收缩转录物,增加心肌收缩力,减轻炎症反应,调节葡萄糖摄取和糖酵解。在肿瘤性疾病中,FTO可通过下调caspase-3的表达等多种方式抑制细胞凋亡。然而,在心肌梗死中,FTO是否可抑制缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡发挥保护作用仍不清楚。MAPK信号通路是连接细胞外刺激信号和细胞内反应的关键桥梁,通过磷酸化各种转录因子、蛋白及酶类等参与细胞的增殖、分化、凋亡以及衰老等病理生理过程,与炎症、肿瘤、免疫和代谢等疾病密切相关。在JNK通路中,上游信号通路的激活可将JNK的Thr183和Tyr185位点磷酸化,使JNK完全激活并进一步磷酸化下游的c-Jun Ser63、73位点使其活化。c-Jun是一种调控凋亡的关键转录因子,能够介导一系列凋亡相关基因的活化,最终使线粒体中的细胞色素C释放,激活caspase-3并诱导凋亡。目前,有少量文献报道了FTO可通过影响MAPK信号通路的激活调控凋亡参与肿瘤的进展。然而,在心肌梗死中,FTO如何变化,FTO是否是急性心肌梗死上调RNA m6A甲基化水平的关键修饰酶,以及是否通过调控凋亡发挥保护作用,这种保护作用是否与MAPK信号通路有关仍不清楚。因此,深入研究RNA m6A甲基化修饰及FTO在急性心肌梗死中的作用将为急性心肌梗死的治疗提供新的靶点和方法。研究目的:1、探究m6A甲基化在心肌梗死及氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）诱导的H9c2细胞损伤模型中的变化,明确心肌梗死及OGD调控m6A甲基化水平的关键修饰酶。2、探究FTO在心肌梗死及OGD诱导的H9c2细胞损伤模型中的作用及可能机制。3、阐明FTO对心肌梗死及OGD诱导的H9c2细胞损伤的影响是否通过MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路实现,并探索FTO作用于MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路的靶点。研究方法:一、建立大鼠急性心肌梗死及OGD诱导的H9c2细胞损伤模型并检测m6A甲基化及其修饰酶的表达变化1、建立大鼠急性心肌梗死模型并检测m6A甲基化及其修饰酶METTL3、ALKBH5、FTO的表达变化。2、应用厌氧产气袋和无糖无血清培养基建立OGD诱导的H9c2细胞损伤模型并检测m6A甲基化及其修饰酶METTL3、ALKBH5、FTO的表达变化。二、建立FTO过表达大鼠及FTO高、低表达H9c2细胞株,检测FTO对大鼠心肌梗死及OGD诱导的H9c2细胞损伤及凋亡的影响1、应用尾静脉注射FTO过表达质粒的腺相关病毒,制作FTO过表达大鼠。应用心脏彩超评估心功能,HE和Masson染色评估心肌梗死面积,评价FTO对大鼠心功能和心肌梗死面积的影响。2、转染含FTO Negative、FTO sh RNA和FTO OE病毒,制作高、低表达FTO的FTO OE和sh FTO细胞株。应用CCK-8试剂盒和LDH试剂盒检测细胞活性和细胞损伤,评价FTO对OGD诱导的细胞损伤的影响。3、应用Tunel荧光染色、WB等方法检测大鼠心肌细胞凋亡率,评估细胞凋亡在大鼠心肌梗死模型中的变化及FTO对心肌梗死诱导的心肌细胞凋亡的影响。三、干预MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路对FTO调控OGD诱导的H9c2细胞凋亡的影响及FTO对MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路的调控作用。1、应用WB法检测大鼠和OGD诱导的H9c2细胞损伤模型中MAP4K4、pJNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun蛋白的表达水平。用同样方法检测高、低FTO表达组OGD刺激后MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路蛋白的表达水平。2、应用JNK抑制剂抑制MAP4K4-JNK-c-Jun下游信号通路后,评估JNK抑制剂对凋亡的影响,以及探索FTO是否通过MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路调控凋亡。3、探索FTO作用于MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路靶点。应用m6A甲基化免疫共沉淀和q RT-PCR的方法检测OGD组、sh FTO+OGD组和FTO OE+OGD组MAP4K4 m6A甲基化水平,探索FTO作用于MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路的靶点及具体机制。研究结果:一、m6A甲基化及其修饰酶在大鼠心梗组织及OGD诱导H9c2细胞损伤模型中的表达。1、RNA m6A甲基化修饰水平及其修饰酶在大鼠心肌梗死模型中的变化。在大鼠心肌梗死模型中,比色法显示与SHAM组相比,术后心肌梗死组织m6A甲基化水平逐渐升高,在第7天达到峰值,之后回落,但仍高于SHAM组。免疫组织化学染色显示与SHAM组相比,术后7天心梗组FTO表达明显下降,METTL3和ALKBH5表达水平无明显变化。q RT-PCR和WB方法显示与SHAM组相比,术后3天AMI组心肌梗死组织FTO表达水平已明显下降,术后7天降至最低水平,之后有所回升,但仍低于假手术组;METTL3和ALKBH5的表达水平在术后7天才明显降低。2、OGD诱导的H9c2细胞损伤模型的建立。在OGD诱导的H9c2细胞损伤模型中,细胞活性呈时间依赖性的降低,LDH活性、活性氧水平和HIF-1α蛋白表达水平呈时间依赖性的升高。3、RNA m6A甲基化修饰水平及其修饰酶在OGD诱导的H9c2细胞损伤模型中的变化。在OGD诱导的H9c2细胞损伤模型中,比色法显示与control组相比,OGD刺激后细胞内总RNA的m6A甲基化水平且呈时间依赖性升高。q RTPCR和WB结果显示,随着OGD刺激时间的延长,FTO表达水平呈时间依赖性降低,METTL3和ALKBH5的表达水平均无明显变化。ROS荧光结果显示,SOD减轻了OGD组的ROS荧光强度,抑制了OGD诱导的氧化应激,同时也减轻了OGD诱导的FTO蛋白表达水平的下降和m6A甲基化水平的升高。二、FTO对大鼠心肌梗死及OGD诱导的H9c2细胞损伤的影响1、过表达FTO对心肌梗死大鼠心功能及梗死面积的影响。q RT-PCR和免疫组织化学染色显示AAV-FTO组FTO m RNA和蛋白表达水平明显升高。心脏彩超显示,与AMI组相比,AAV-FTO组大鼠LVEF和LVFS明显升高,IVS厚度明显增厚,LVIDd明显减小。HE和Masson染色显示,与AMI组相比,AAVFTO组心肌梗死面积明显减小。2、高、低表达FTO对OGD诱导的H9c2细胞损伤的影响。GFP荧光结果显示与对照组相比,FTO OE、sh FTO和NC组GFP阳性率细胞明显升高。WB结果显示与control组相比,sh FTO组FTO蛋白表达水平下降,FTO OE组FTO蛋白表达水平升高,NC组FTO蛋白表达水平无明显变化。CCK-8结果显示,与NC+OGD组相比,sh FTO+OGD组细胞活性明显下降,LDH活性升高,FTO OE+OGD组细胞活力上升,LDH活性下降。3、生物信息学探索FTO减轻心肌梗死及OGD诱导的H9c2细胞损伤的病理生理学机制。应用生物信息学的方法显示,数据集GSE112789中FTO过表达之后明显下调了75个基因的m6A甲基化水平,上述基因的GO分析显示,在生物过程组分中,m6A甲基化下调基因富集于凋亡的负调控组分,KEGG显示FTO可能通过影响MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路调控凋亡。4、过表达FTO对大鼠心肌梗死诱导的细胞凋亡的影响。Tunel染色结果显示,与SHAM组相比,术后3天、7天和28天心肌梗死周边区心肌细胞凋亡率明显高于SHAM组,并且随着时间的延长凋亡率逐渐升高,术后7天升至最高,之后回落,但仍高于SHAM组。术后7天心肌梗死周边区Tunel染色结果显示,与AMI组相比,AAV-FTO+AMI组Tunel染色阳性率细胞数明显下降,AAVvector+AMI组心肌梗死周边区心肌细胞凋亡率无明显差异。5、高、低表达FTO对OGD诱导的H9c2细胞凋亡的影响。随着OGD刺激时间的延长,Tunel染色结果显示Tunel阳性率细胞数呈时间依赖性增多,应用Annexin-APC/7ADD染色试剂盒行流式细胞术结果显示细胞早期凋亡率呈时间依赖性升高,WB结果显示,cleaved caspase、bak和bax细胞凋亡蛋白表达量呈时间依赖性上升,bcl-2抗凋亡蛋白表达量呈时间依赖性下降。与NC+OGD组相比,Tunel染色结果显示sh FTO+OGD组细胞Tunel阳性率细胞明显升高,FTO OE+OGD组明显下降;应用Annexin-APC/7ADD染色试剂盒行流式细胞术结果显示sh FTO+OGD组细胞早期凋亡率明显升高,FTO OE+OGD组明显下降;WB结果显示,sh FTO+OGD组cleaved caspase/caspase 3、bak和bax相对表达量明显升高,bcl-2相对表达量明显下降,FTO OE+OGD组cleaved caspase/caspase 3、bak和bax相对表达量明显下降,bcl-2明显升高。三、FTO通过抑制MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路抑制OGD诱导的H9c2细胞凋亡1、MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路在大鼠心肌梗死中的表达变化。WB结果显示,与SHAM组相比,术后3天、7天和28天AMI组大鼠心肌梗死周边区心肌组织MAP4K4、p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun相对表达量逐渐升高,术后7天达到高峰,之后回落,但仍高于SHAM组。2、MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路在OGD诱导的H9c2细胞损伤模型中的表达变化。WB结果显示,与control组相比,OGD刺激2、4、6h H9c2细胞MAP4K4、p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun相对表达量呈时间依赖性升高。与NC+OGD组相比,sh FTO+OGD组细胞MAP4K4、p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun相对表达量升高,FTO OE+OGD组MAP4K4、p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun明显下降。表明FTO可抑制OGD诱导的MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路的激活。3、抑制MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路对FTO调控凋亡的影响。加入JNK抑制剂后,NC+OGD+JNK IN、sh FTO+OGD+JNK IN、FTO OE+OGD+JNK IN组pJNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun相对表达量分别较NC+OGD、sh FTO+OGD、FTO OE+OGD组明显下降,表明MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路被抑制。抑制MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路后,分别与NC+OGD、sh FTO+OGD、FTO OE+OGD组相比,NC+OGD+JNK IN、sh FTO+OGD+JNK IN和FTO OE+OGD+JNK IN组TUNEL染色阳性率细胞明显下降;流式细胞术也显示细胞早期凋亡率明显下降;WB结果显示cleaved caspase/caspase 3、bak和bax相对表达量显著下降,bcl-2的相对表达量升高。表明FTO可通过抑制MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路的激活减轻OGD诱导的细胞凋亡4、FTO作用于MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路靶点分析。m6A免疫共沉淀和q RT-PCR结果显示,与NC+OGD组相比,sh FTO+OGD组MAP4K4 m6A甲基化修饰水平明显升高,FTO OE+OGD组明显下降,表明FTO可调控OGD诱导的H9c2细胞损伤模型中MAP4K4 m RNA m6A甲基化水平。与NC+OGD组相比,sh FTO+OGD和FTO OE+OGD组MAP4K4 m RNA表达水平无明显差异,但sh FTO+OGD组MAP4K4蛋白表达水平明显升高,FTO OE+OGD组明显下降,表明在FTO通过去除MAP4K4 m RNA m6A甲基化修饰减慢其翻译下调了MAP4K4的表达,进而抑制了JNK和c-Jun蛋白的磷酸化,抑制了MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路的激活。结论:1、体内、外实验证实了m6A甲基化水平与心肌梗死诱导的心肌细胞损伤相关,m6A甲基化的升高与心肌梗死诱导的去甲基化酶FTO的下降有关。2、体内、外实验发现去甲基化酶FTO的下调与心肌梗死诱导的心肌细胞凋亡有关。3、去甲基化酶FTO通过抑制MAP4K4-JNK-c-Jun信号通路的激活减轻了心肌梗死诱导的心肌细胞凋亡,减小了心肌梗死面积,改善了心功能。