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戊型肝炎(Hepatitis E, HE)是一种经粪口途径传播的急性传染病,在世界各地尤其是发展中国家广泛流行,在发达国家也有散发。HE病死率约为0.4%,远较其他各型肝炎高,患者多为青壮年,孕期妇女病死率高达20%[1-2],给社会带来了很大危害。近年来发现在猪等动物中也有广泛的戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)感染,使该病成为一种人畜共患病[18]。目前HE尚无特异的治疗方法,也无主动和被动免疫制剂可供预防。国内外学者均在致力于HEV疫苗的研究。而衡量疫苗是否有预防疾病作用的标准,就是看疫苗能否诱导机体产生中和抗体。中和抗体不同于一般的抗体,它能与病毒结构蛋白上的中和抗原表位结合,阻断病毒与敏感细胞的结合,从而阻止该病毒入侵敏感细胞,使病毒失去感染性,对机体有保护作用,对疾病的诊断、预防和预后起着重要作用。检测中和抗体的常用方法有动物体内试验和细胞培养体外试验两种,但目前对HEV敏感的动物只有非人灵长类动物[6],使用非人灵长类动物建立动物模型,价格昂贵,方法繁琐,试验周期长,动物饲养要求高,耗费大量的人力物力,难以在基层广泛使用。另外,由于HEV缺乏有效的细胞培养体系,传统的体外中和试验鉴定难以进行,1997年Meng [10]等发明了基于PCR和细胞培养的体外中和试验并用于HEV中和抗体的检测,但该体外中和试验需要细胞培养及RT-PCR技术,方法繁琐,也难以普遍推广应用。针对HEV中和抗体检测存在的问题,本研究的目的是建立一种简便易行的检测HEV中和抗体的方法,并进行初步评价。本研究利用我们先前获得的能够稳定分泌HEV中和性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,大量制备和纯化HEV中和性McAb,并进行酶标记,使待测样本中的HEV中和抗体与酶标记HEV中和性McAb竞争结合包被抗原上的HEV中和抗原表位,最后根据酶作用底物显色反应减弱的程度,实现对生物学样本中的HEV中和抗体的竞争酶联免疫检测。本研究分为三个部分,具体研究结果如下:一.HEV中和性单克隆抗体的大量制备、鉴定和纯化本实验室通过B淋巴细胞杂交瘤技术,以p166Chn和p166Bur免疫小鼠后获得3株杂交瘤细胞株5G5、1G10和3G1。这3株细胞所分泌的McAb均不与单独包被的GST发生结合,是针对HEV的特异性抗体。它们分泌的McAb能和7种不同基因型来源的p166均发生阳性反应,为p166共同型McAb。用这3株杂交瘤细胞制备出大量的McAb,并对McAb进行了HEV中和活性的鉴定,证实它们具有中和HEV的作用,是HEV中和性McAb。分别用正辛酸法,DEAE 52阴离子交换层析法,Protein-G亲和层析法3种不同的方法对McAb进行纯化,并对这3种纯化方法的结果进行比较。我们将纯化得到的产物系列稀释后进行间接ELISA检测抗体滴度,显示出用正辛酸法和Protein-G亲和层析的方法纯化的McAb滴度比DEAE 52阴离子交换层析法高,分别可达1:106(5G5),1:105(1G10)1:105(3G1)。经SDS-PAGE,纯化后的McAb仅在重、轻链位置出现明显条带,表明纯化后的McAb纯度较高。最终选用较经济、