生殖细胞的数量和质量对哺乳动物的繁殖能力至关重要。雌性动物卵母细胞的数量是非常有限的,超过一半的卵母细胞在出生前就被消除掉,只有少数卵母细胞在动物发情时被激活并达到成熟阶段。当卵母细胞被激活或丢失时,卵巢不能补充新的卵母细胞,所以雌性动物的繁殖效率和繁殖年限受到很大的限制。然而,到目前为止,导致卵子数目持续快速递减的原因和机制尚不明确,且相关的研究工作较少。在胚胎发育过程中,表观遗传修饰发挥着至关重要的作用,组蛋白修饰作为表观遗传中重要的修饰方式参与了生殖细胞发生、迁移和分化的过程。本研究试图建立胎鼠性腺体外培养的方法,通过在培养液中添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂,利用全组织免疫荧光3D成像技术来研究胎鼠卵巢发育过程中卵母细胞消退现象和组蛋白乙酰化在其中的变化与作用,并揭示其可能的作用机制。1.胎鼠性腺体外培养方法的建立由于雌雄性腺中的生殖细胞都是由原始生殖细胞迁移分化而来,为了研究卵母细胞消退过程,利用全组织免疫荧光3D成像技术观察并分析了体内性腺发育过程和生殖细胞的分布与数量;建立胎鼠性腺体外培养方法,研究胎鼠卵巢体外培养的最佳体系。采集不同胎龄的小鼠体内性腺,用特异性抗体Tra98标记生殖细胞,用激光共聚焦显微镜逐层扫描,确定生殖细胞在性腺中的分布,并用Imaris软件生成3D模型统计生殖细胞数目。在此基础上,采集13.5 dpc的胎鼠性腺中肾复合体,通过性腺单独贴壁培养、性腺中肾共同贴壁培养、性腺中肾共同半悬浮培养和性腺单独半悬浮培养四种方案,观察性腺在体外培养中的发育过程,并在培养不同时间后,以睾丸为对照用全组织免疫荧光观察和统计卵巢中Tra98标记的生殖细胞分布和数目。结果显示,胎鼠卵巢中生殖细胞成均匀分布且数量随着胎龄的增加而显著减少;胎鼠睾丸中生殖细胞成管状分布但其数量无法准确统计。在体外培养中,卵巢单独半悬浮培养是四种方案中最好的,卵巢的形态和结构及其生殖细胞的分布和数量基本与体内卵巢一致;但是,体外培养睾丸的形态与体内睾丸不一致,且生殖细胞并非管状分布。这说明性腺单独半悬浮培养适合于卵巢,但可能并不适合于睾丸,或者睾丸的体外培养需要其他条件。2.组蛋白乙酰化在卵母细胞消退中的变化和作用组蛋白修饰在胚胎发育和生殖细胞发生的过程中发挥着重要作用。利用免疫印迹分析了不同胎龄小鼠体内性腺中组蛋白乙酰化(H4K8ac和H4K12ac)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC1)的水平;在此基础上,通过在培养液中添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA),利用全组织免疫荧光3D成像技术来研究其对卵母细胞消退的影响,利用免疫印迹分析组蛋白乙酰化的变化。结果显示,H4K8ac和H4K12ac在体内雌雄性腺中的水平随着胎龄的增加而显著减少,但HDAC1的水平则保持一致;在体外培养条件下,TSA对卵巢的影响存在明显的剂量效应,高浓度TSA(50-1000ng/ml)产生明显的毒性,胎鼠卵巢停止发育且皱缩死亡,而低浓度TSA(10ng/ml)处理的胎鼠卵巢的形态与对照组相比无显著差异;进一步分析表明低浓度TSA处理后卵巢中生殖细胞数目显著少于对照组,同时H4K8ac和H4K12ac显著升高,但HDAC1无显著性差异。这说明TSA抑制了性腺中H4K8ac和H4K12ac的下降,进而加速了生殖细胞递减的趋势。综上所述,卵巢单独半悬浮体外培养可以较高的复制性腺的体内发育过程,组蛋白乙酰化水平的下降与卵母细胞的消退具有相关性,而TSA抑制组蛋白乙酰化水平的下降可以加速胎鼠生殖细胞消退的过程。