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目的:雄黄主含二硫化二砷（As2S2）或四硫化四砷（As4S4）。由于受传统中药无毒无副作用的用药习惯的影响,而未科学（长期、超量和不规范）合理使用单味雄黄或其复方制剂引起的药源性砷中毒事件时有报道,其临床表现为全身多系统损害,以消化系统、皮肤损害为主。流行病学调查和动物实验均显示长期砷暴露可导致语言、认知、行为、听力及运动方面的障碍,严重者会导致智力发育迟缓及神经系统缺陷,即使脱离砷接触,其中枢神经系统功能也不易恢复正常。雄黄中的砷是雄黄毒性的主要来源,脑是其毒性靶器官之一,由雄黄引发的对神经系统损伤的机制受到越来越多的关注。作为调节细胞内抗氧化表达的关键转录因子Nrf2,是外源性有毒物质和氧化应激的重要感受器,Nrf2活性的改变与自然衰老过程和人类慢性疾病的发病机制有关,如神经退行性疾病等。自噬参与细胞的一系列生长过程,如生长、分化、死亡等生理过程,也被称为Ⅱ型程序性细胞死亡。课题组前期研究发现,雄黄可持续激活Nrf2信号通路,那么雄黄持续激活Nrf2过程是否受其上游信号分子MAPK和AKT的影响。Nrf2也可介导Nrf2/Keap1/p62信号通路调控自噬,又有研究表明自噬和凋亡在功能上存在联系,即自噬为凋亡所需,对于通过自噬无法处理的细胞,最终可能会诱导细胞凋亡的发生。目前有关MAPK和AKT介导Nrf2/Keap1/p62信号通路调控自噬促进凋亡在雄黄所致神经毒性中的作用未见报道。因此,建立p38、ERK1/2、JNK、AKT以及自噬特异性抑制剂模型和Nrf2 sh RNA基因沉默大鼠模型,阐明MAPK和AKT介导Nrf2调控自噬在雄黄所致神经系统毒性中的作用,揭示雄黄所致神经系统的毒性机制,为早期采取有效措施预防和控制药源性慢性砷中毒的发生、指导临床合理用药提供理论和现实依据。研究方法:由中国医科大学实验动物中心提供的健康SPF级雌性SD大鼠96只,4周周龄,体重45±5g,。喂养过程中将使用专用笼具、专用垫料以及饲料,自由饮水,室温为22±5℃,相对湿度控制在50±10%,保证光照12 h/日,昼夜循环饲养。根据体重随机分为16组,即对照组、雄黄组、p38 MAPK抑制剂组、雄黄+p38 MAPK抑制剂组、ERK1/2抑制剂组、雄黄+ERK1/2抑制剂组、JNK抑制剂组、雄黄+JNK抑制剂组、AKT抑制剂组、雄黄+AKT抑制剂组、3MA抑制剂组、雄黄+3MA抑制剂组、假手术组、假手术雄黄组、Nrf2 sh RNA组和雄黄+Nrf2 sh RNA组。以0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）水溶液为混悬介质,雄黄给药剂量为0.9 g/kg,对照组给予0.5%CMC-Na,每天1次连续灌胃给药8周;第6周开始,腹腔注射抑制剂,对照组和雄黄组注射浓度为1%DMSO,抑制剂组分别给予SB203580、PD98059、SP600125和LY249002及3MA,剂量除3MA为20 mg/kg外,其他均为10 mg/kg,每3天1次,共3周。后4组在大鼠海马CA1区域（坐标前囟后2.8 mm,旁开2.8 mm,深度为2.0 mm）注射,假手术组和假手术雄黄组给予空病毒,剩余2组分别给予Nrf2-sh RNA。手术3周后以0.5%CMC-Na水溶液为混悬介质,给予雄黄,处理与上述相同。染毒8周后,旷场实验和新事物识别实验检测大鼠的学习认知能力,透射电子显微镜方法观察仔鼠海马神经元中线粒体和突触的超微结构的异常变化。Western blot法检测Nrf2、自噬相关指标及凋亡相关指标的检测。免疫共沉淀方法检测p62与Keap1、Nrf2与p62蛋白相互作用情况。结果:1、雄黄灌胃后,可在其脑组织中检测到砷的蓄积。2、雄黄处理后,与CON组相比,REA组大鼠在旷场内的移动的总路程减少（P<0.05）,触壁站立次数减少（P<0.05）,而且平均速度降低（P<0.05）;在实验阶段,CON组大鼠对新事物的探索时间明显高于REA组（P<0.05）。3、雄黄暴露后,大鼠海马神经元细胞形态不规则,胞核疏松、透明,表面呈锯齿状;突触结构受损,神经元之间信号传递减慢或受阻;出现受损的线粒体等。4、雄黄可激活大脑中ERK1/2、JNK、p38、PI3K/AKT信号分子,并且雄黄可以通过ERK1/2、JNK、p38、PI3K/AKT信号通路活化大鼠大脑Keap1/Nrf2系统,而加入上述信号通路抑制剂后可以明显减弱由雄黄引起的Nrf2、Keap1、p62蛋白高表达的情况。5、雄黄促进Keap1与Nrf2及p62与Keap1的结合作用。抑制Nrf2后,削弱了雄黄对Nrf2/Keap1以及p62与Keap1复合体的破坏作用。6、雄黄可以引起大鼠海马中自噬相关蛋白的激活,这些蛋白包括自噬的起始部分（ULK1、Atg13、Beclin1等蛋白）以及自噬小体延伸和自噬溶酶体形成过程蛋白（Atg4B、LC3II/I等蛋白）。当Nrf2沉默后,上述蛋白的表达水平均有显著的下降,表明雄黄可以通过Nrf2的表达来调控自噬。7、雄黄暴露后会引起大脑海马Caspase8、Caspase3以及BAX/Bcl2的水平明显升高;而抑制自噬后,Caspase8、Caspase3以及BAX/Bcl2的蛋白表达水平相比于雄黄组降低。结论:雄黄中砷可以通过血脑屏障,蓄积于脑组织中,产生中枢神经系统毒性,其毒性机制与MAPK和AKT信号分子介导Nrf2/Keap1/p62信号通路扰动自噬促进凋亡有关。