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胶质母细胞瘤是神经系统最常见的高致命性恶性肿瘤,尽管目前治疗手段已经有了很多进展,其预后仍然很差。它占所有神经胶质肿瘤的60%,患者的总体生存率在过去20年中却没有发生显著变化。即使进行了积极的治疗,基本上所有的胶质母细胞瘤都会复发,最终导致死亡。肿瘤的侵袭是一种不同组织学类型的细胞恶性转化时的复杂行为,涉及一系列分子间、细胞间、细胞与胞外基质间相互作用的多机制过程,这些过程使得肿瘤细胞迁移并侵袭到周围健康脑组织中。以往的研究显示,蛋白酶、胞外基质成分、粘连细胞分子的相互作用及激活相关的多种信号通路在神经胶质瘤细胞侵袭和转移中起重要作用,每一成分都可以被视为潜在神经胶质瘤治疗靶点。近来的研究提示某些在应激状态下被激活的信号分子,在特定情况下发挥促进肿瘤细胞迁移的作用,很可能促进了胶质母细胞的侵袭。ATF3(activating transcription factor 3,转录激活因子3)是细胞应激反应中最早表达的转录因子之一,是介导细胞外信号如细胞应激、生长因子和激素等产生生物效应作用的关键调节者,是一种早期反应基因。许多研究都证实ATF3还是一种适应性反应基因,是细胞对那些扰乱机体内稳态信号的适应性反应网络的中心,它使细胞增殖加速,诱导细胞从静止期进入细胞周期,在多种恶性肿瘤组织中高表达,与肿瘤侵袭、转移及预后关系密切。例如,在乳腺癌组织[44]、恶性前列腺癌组织[45]以及何杰金氏病患者中[46]发现均ATF3高度表达。因此,其成为研究恶性肿瘤侵袭过程中的重要热点。ATF3对恶性胶质瘤侵袭作用的研究在国内外尚属空白,为探讨其在恶性胶质瘤发展侵袭过程中的作用以及其是否可能成为恶性胶质瘤治疗的靶点,本研究采用了RNA干扰和分子生物学技术对胶质瘤母细胞瘤进行了体内和体外的相关研究。实验目的:1.观察ATF3、Maspin和MMP2在人脑各级别胶质瘤中的表达情况,评价三者在m RNA和蛋白水平的表达趋势和可能的关联性,推测ATF3的表达在胶质瘤中的可能意义。2.构建ATF3-si RNA真核表达载体,观察ATF3-si RNA对人脑胶质母细胞瘤U373细胞株活性、细胞周期、凋亡和侵袭情况及Maspin和MMP2表达水平的影响,评价ATF3-si RNA在体外对U373细胞的抑制作用。3.观察ATF3-si RNA对裸鼠体内人脑胶质瘤移植瘤的抑制作用及对Maspin和MMP2表达水平的影响,评价ATF3-si RNA在体内对U373细胞的抑制作用。主要内容:第一部分:ATF3、Maspin和MMP2在人脑胶质瘤中表达的实验研究方法:1.运用免疫组织化学检测人正常脑组织和各级胶质瘤组织中ATF3、Maspin和MMP2蛋白的表达情况,观察三者在细胞中的定位和分布。2.实时运用荧光定量PCR检测人正常脑组织和各级胶质瘤组织中ATF3、Maspin和MMP2的m RNA相对表达量,评价三者在m RNA水平的表达趋势和关联性。3.以western blot检测人正常脑组织和各级胶质瘤组织中ATF3、Maspin和MMP2蛋白表达相对量,评价三者在蛋白水平的表达趋势和关联性。结果:1.ATF3和MMP2蛋白表达随胶质瘤病理分级的增高而增强,Maspin蛋白表达随胶质瘤病理分级的增高而减弱。2.ATF3和MMP2 m RNA相对表达量随胶质瘤病理分级的增高而增多,II-IV胶质瘤和正常脑组织相比,有统计学意义(P<0.05);Maspin m RNA相对表达量随胶质瘤病理分级的增高而减少,I-IV胶质瘤和正常脑组织相比,有统计学意义(P<0.05)。3.ATF3和MMP2蛋白相对表达量随胶质瘤病理分级的增高而增多,II-IV胶质瘤和正常脑组织相比,有统计学意义(P<0.05);Maspin蛋白相对表达量随胶质瘤病理分级的增高而减少,I-IV胶质瘤和正常脑组织相比,有统计学意义(P<0.05)。第二部分:ATF3-si RNA体外抑制胶质母细胞瘤的实验研究第一章U373MG细胞中ATF3 si RNA的筛选与鉴定方法:1.设计合成三对完全互补的63bp序列,两端带有Hind III和Bam H I粘性末端酶切位点,便于与p Silencer2.1 U6载体克隆连接。将ATF3-si RNA寡核苷酸片段退火,与p Silencer2.1 U6载体连接,筛选阳性菌落,构建p Silencer/si R-ATF3表达载体。2.转染人脑胶质母细胞瘤U373GM细胞株,荧光显微镜观察GFP的表达,确定最佳转染效率。3.转染48h后,提取RNA,实时荧光定量PCR检测p Silencer/si R-ATF3表达载体对ATF3表达水平的影响。4.转染72h后,收集细胞,western blot检测p Silencer/si R-ATF3表达载体对ATF3表达水平的影响。结果:1.酶切鉴定及测序显示p Silencer/si R-ATF3表达载体构建成功。2.转染效率达到70%以上。3.实时荧光定量PCR和western blot结果显示,p Silencer-si R1-ATF3和p Silencer-si R2-ATF3表达载体可以有效降低ATF3基因在U373MG细胞中的表达水平。第二章ATF3-si RNA对U373MG细胞生物学活性的实验研究方法:分为5个实验组:①Cell对照组;②control-si RNA组;③ATF3-si RNA组;④顺铂处理组;⑤ATF3-si RNA+顺铂处理组1.以MTT法检测各实验组细胞活性及对顺铂的敏感性的变化;2.以流式细胞术检测各实验组细胞增殖指数,观察ATF3基因表达抑制后对细胞周期的影响;3.以TUNEL法检测各实验组细胞凋亡情况,观察ATF3基因表达抑制后对细胞凋亡的影响;4.以Transwell实验检测各实验组的细胞迁移数,观察其侵袭能力的变化;5.以免疫细胞化学法检测各实验组ATF3、Maspin和MMP-2蛋白表达情况;6.实时荧光定量PCR法检测各实验组ATF3、Maspin和MMP-2 m RNA表达情况,观察ATF3基因表达抑制后三种基因m RNA相对表达量的变化;7.Western blot法检测各实验组ATF3、Maspin和MMP-2蛋白表达情况,观察ATF3基因表达抑制后三种蛋白相对表达量的变化。结果:1.MTT法检测结果:相对于Cell对照组和control-si RNA组,ATF3-si RNA组细胞活性明显降低(P<0.05),顺铂处理组和ATF3-si RNA+顺铂处理组细胞活性随时间逐渐降低(P<0.05),顺铂处理组和ATF3-si RNA+顺铂处理组没有明显差异(P>0.05)。2.流式细胞术检测结果:相对于Cell对照组和control-si RNA组,ATF3-si RNA组和顺铂处理组细胞阻滞于G1期,S期细胞数相对较少(P<0.05),ATF3-si RNA+顺铂处理组S期细胞数的减少更明显一些(P<0.05)。3.TUNEL法检测结果:相对于Cell对照组和control-si RNA组,ATF3-si RNA组和顺铂处理组细胞凋亡明显增加(P<0.05),ATF3-si RNA+顺铂处理细胞凋亡的程度更严重一些(P<0.05)。4.Transwell实验检测结果:相对于Cell对照组和control-si RNA组,ATF3-si RNA组和顺铂处理组细胞迁移能力明显下降(P<0.05),ATF3-si RNA+顺铂处理组对迁移能力的影响与顺铂组处理无明显区别(P>0.05)。5.相对于Cell对照组和control-si RNA组,ATF3和MMP2的蛋白表达强度和相对表达量及m RNA相对表达量在顺铂处理组、ATF3-si RNA组和ATF3-si RNA+顺铂处理组中依次减少(P<0.05),Maspin蛋白表达强度和相对表达量及m RNA相对表达量在ATF3-si RNA组明显增强(P<0.05),在顺铂处理组和ATF3-si RNA+顺铂处理组中依次减少(P<0.05)。第三部分:ATF3-si RNA对胶质母细胞移植瘤生长影响的实验研究方法:1.建立人脑胶质母细胞异种移植瘤裸鼠模型。随机分为5个实验组:①Cell组;②Control-si RNA组;③ATF3-si RNA组;④顺铂处理组;⑤ATF3-si RNA+顺铂处理组,每组8只裸鼠。共进行15次瘤旁注射,隔日一次。2.以HE染色法观察裸鼠体内人脑胶质母细胞移植瘤治疗前后的组织学形态。3.TUNEL法检测裸鼠体内人脑胶质母细胞移植瘤治疗前后的生长抑制情况。4.以免疫组织化学法检测各实验组ATF3、Maspin和MMP-2蛋白表达情况,观察裸鼠体内人脑胶质母细胞移植瘤治疗前后三种蛋白的表达变化。5.实时荧光定量PCR法检测各实验组ATF3、Maspin和MMP-2 m RNA表达情况,观察裸鼠体内人脑胶质母细胞移植瘤治疗前后三种基因m RNA相对表达量的变化。6.Western blot法检测各实验组ATF3、Maspin和MMP-2蛋白表达情况,观察人脑胶质母细胞移植瘤治疗前后三种蛋白相对表达量的变化。结果:1.治疗前后裸鼠皮下肿瘤的组织学观察:空白组和control-si RNA组肿瘤细胞较大,大小不一,核染色质多,异型性明显;ATF3-si RNA组、顺铂处理组和ATF3-si RNA+顺铂处理组肿瘤细胞小,核染色质稀疏,异型性不明显,肿瘤组织中有点片状坏死灶,依次增大。2.TUNEL法检测结果:相对于空白组和control-si RNA组,ATF3-si RNA组和顺铂处理组细胞凋亡明显增加(P<0.05),ATF3-si RNA+顺铂处理细胞凋亡的程度更严重一些(P<0.05)。3.相对于空白组对照组和control-si RNA组,ATF3和MMP2的蛋白表达强度和相对表达量及m RNA相对表达量在顺铂处理组、ATF3-si RNA组和ATF3-si RNA+顺铂处理组中依次减少(P<0.05),Maspin蛋白表达强度和相对表达量及m RNA相对表达量在ATF3-si RNA组明显增强(P<0.05),在顺铂处理组和ATF3-si RNA+顺铂处理组中依次减少(P<0.05)。结论:1.ATF3在人脑胶质瘤中高表达,ATF3、Maspin和MMP2三者的表达具有相关性,ATF3、MMP-2高表达及Maspin低表达与胶质瘤的进展密切相关。2.ATF3-si RNA能有效降低U373MG细胞活性,抑制细胞增殖,阻滞细胞周期进程,促进凋亡,阻止侵袭。3.ATF3-si RNA能有效下调U373MG细胞中ATF3和MMP2的表达,上调Maspin表达。4.ATF3-si RNA在体内外对胶质母细胞瘤具有抑制作用,是一种有效的治疗手段。