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正向遗传学筛选可以揭示特定表型相对应的遗传基因,将生物现象与其相应的遗传因素直接联系起来。在哺乳动物的全基因组筛查中,CRISPR/Cas9基因编辑技术是开展正向遗传学筛选的一种强大而精准的方法。靶向人全基因组的sgRNA文库在Cas9内切酶作用下生成的突变细胞文库是进行表型高通量筛选的完美平台。基于该技术构建的不同细胞文库已广泛应用于多种功能型基因的筛选,包括药物作用基因筛选、肿瘤功能基因筛选及病毒感染基因筛选等。本文已利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了人全基因组敲除的HeLa细胞文库,并初步应用于HIV-1感染早期宿主依赖蛋白的筛选,亦为实验室后续研究提供有效的高通量筛选平台。本研究利用双质粒系统构建敲除细胞文库,即先将Cas9基因稳定表达于HeLa细胞中,在确定Cas9的高效蛋白切割活性前提下再导入人全基因组sgRNA文库构建敲除细胞库,以确保更低的脱靶效率。本研究分为4个实验部分:1.构建HeLa-Cas9细胞系。通过慢病毒载体系统,建立了稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系,利用流式分选细胞术获得9株表达Cas9的单克隆细胞系。之后利用pXPR-011质粒（该质粒包含GFP序列和靶向GFP蛋白的sgRNA序列）包装的慢病毒鉴定单克隆细胞系中Cas9蛋白的敲除效率,获得两株细胞的敲除效率分别为79%和81%。利用CCK-8检测细胞活性后,选取细胞活性与野生型细胞活性一致的细胞株HeLa-Cas98,进行单克隆化选取其中敲除效率高的HeLa-Cas98-6为候选细胞株。2.扩增sgRNA文库。本研究通过电转化的方式,扩增商品化的人全基因组文库（GeCKO）,保证每个sgRNA的拷贝数至少为100个,经过NGS测序后该文库的覆盖度为100%和均一性为5.2左右（一般标准≤15）,均达到使用要求。3.构建敲除细胞文库。利用扩增的GeCKO文库（A库）包装慢病毒,检测病毒滴度后以低滴度（MOI≤0.3）感染候选细胞系,经过最佳浓度嘌呤霉素培养液筛选1-2周,收集存活细胞。本研究从制备慢病毒到感染筛选,经三次重复,共获得3批次敲除细胞文库。提取文库基因组扩增sgRNA文库,建库后进行全基因组测序和生物信息学分析sgRNA的reads数,sgRNA覆盖率分别为97.80%、98.38%和94.37%。4.HeLa敲除文库的初步应用。利用VSVG包装的表达GFP的HIV-1假病毒以MOI=510的病毒感染剂量感染HeLa-GeCKO细胞系,流式检测结果显示存在显著差异,揭示存在与HIV-1复制相关的早期宿主依赖因子,需要增加细胞数量以获得更多基因组,并通过深度测序验证。基于上述结果与数据,本研究成功筛选到一株Cas9敲除效率高且细胞活性与野生型相比无明显差异的HeLa单克隆细胞株HeLa-Cas98-6作为构建敲除细胞文库的候选细胞株。在成功获得高覆盖度和良好均一性的GeCKO文库的前提下,建立了人HeLa细胞CRISPR/Cas9全基因组敲除文库（HeLa-GeCKO）。该文库作为各种表型的筛选平台,为发掘更多的已知基因的未知功能,筛选为遗传疾病的治疗和药物靶点奠定基础。