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研究背景与目的呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是呼吸道中一种常见的病原体,是引起人类急性细支气管炎和肺炎的主要原因。全球范围内,严重RSV下呼吸道感染（Lower respiratory tract infection,LRTI）的最高发病人群为6个月以下婴幼儿,RSV LRTI是其每年住院和死亡的主要原因。流行病学显示,RSV与3310万LRTI病例、320万相关住院病例和12万例5岁以下儿童死亡有关。超过80%的儿童到两岁时至少感染一次RSV,此外,病毒的反复感染可以伴随整个生命过程。婴儿在出生时从封闭的宫内环境突然进入来自病原体过多的外界环境中,由于机体的先天免疫系统和适应性免疫系统在很大程度上发育不成熟,无法在这一脆弱时期提供所需的保护,因此机体对病原体的抵抗能力较差,使其更易受到RSV的感染,增加成年后哮喘的易感性。除此之外,母亲在妊娠期间感染RSV后,病毒能够通过胎盘垂直传播给胎儿,增加了婴儿出生后患哮喘的风险。总而言之,生命早期的RSV相关疾病与成年后慢性呼吸系统并发症如反复发作的喘息和哮喘等肺部功能障碍有关。然而,早期感染RSV可能导致的这些迟发性后遗症的免疫机理尚不清楚。探究生命早期感染RSV对成年后呼吸系统疾病的影响,能够为疾病的有效治疗和预防以及降低继发呼吸系统疾病的发病率提供有力依据,这也是近年来引起广泛医学研究者高度重视的研究内容。为了探究生命早期感染RSV对成年后哮喘发生发展的影响,我们建立三种小鼠模型来对此进行研究:第一种是出生后第3周的幼鼠建立反复感染RSV的模型,第二种是出生后第5天的新生鼠感染一次RSV的模型,第三种是母鼠怀孕中后期感染两次RSV对子代小鼠肺部炎症影响的模型。这三种模型均在小鼠成年后6周龄开始建立卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的哮喘模型。以此来初步了解RSV/OVA诱导的病毒相关哮喘模型中小鼠机体的炎症及免疫情况。实验方法1.将RSV病毒液接种于Hela细胞进行扩增,观察细胞病变效应,并收集纯化病毒。使用RSV病毒液以滴鼻的方式感染BALB/c小鼠18 h,收集支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）制备细胞涂片,并通过迈格林华-姬姆萨染色（May-Grunwald-Giemsa stain,MGG）对炎症细胞进行分类计数;利用实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测小鼠肺组织中RSV N蛋白的m RNA表达情况。2.将怀孕的母鼠随机分成五组,第一组为母鼠生产后的子代小鼠全程使用PBS处理（PBS组）,第二组为母鼠产下小鼠后长至成年建立哮喘模型（OVA组）,第三组在子鼠脱离哺乳期滴鼻感染RSV（I组）,第四组在子鼠出生5天滴鼻感染RSV（N组）,第五组在孕鼠怀孕中后期滴鼻感染RSV（P组）。第三四五组小鼠长至成年后诱导哮喘,同时用PBS作为对照。因此本研究共建立8组子代小鼠模型,分别是PBS组（对照组）、OVA组（哮喘组）、IRSV+PBS组（IRP组）、IRSV+OVA组（IRO组）、NRSV+PBS组（NRP组）、NRSV+OVA组（NRO组）、PRSV+PBS组（PRP组）、PRSV+OVA组（PRO组）。3.获取小鼠外周血和BALF分别制备血涂片和细胞涂片,对不同类型细胞进行分类计数。4.获取小鼠左叶肺组织置于多聚甲醛溶液中固定,制备石蜡切片,经苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin stain,HE）和过碘酸-雪夫染色（Periodic AcidSchiff stain,PAS）后观察肺部炎症细胞浸润、粘液分泌情况并进行评分。5.获取小鼠肺、气管、肺门淋巴结和脾脏,利用q RT-PCR检测相关细胞因子和趋化因子的m RNA表达情况。6.利用ELISA检测小鼠BALF上清液中CCL28和IL-17A的蛋白表达。实验结果1.RSV导致Hela细胞病变和小鼠肺部炎症。RSV病毒液接种于Hela细胞后3天左右可观察到明显的细胞病变效应,表现为单细胞层被破坏并形成大量合胞体。RSV滴鼻感染小鼠18 h后,RSV感染组中BALF的总细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量均明显高于PBS对照组;RSV感染组的肺组织中RSV N蛋白m RNA的表达水平也明显升高,PBS对照组中未检测到RSV N蛋白m RNA的表达。2.生命早期感染RSV成年后诱导哮喘的小鼠BALF炎症细胞数升高以及外周血部分炎症细胞百分比升高。BALF细胞分类计数结果显示,与OVA组相比,IRO组、NRO组、PRO组的总细胞数和嗜酸性粒细胞数均增加,此外,IRO组巨噬细胞、淋巴细胞数升高而中性粒细胞数减少;NRO组淋巴细胞数升高。外周血涂片细胞计数结果显示,与OVA组相比,IRO组嗜酸性粒细胞百分比升高;NRO组中性粒细胞百分比升高且淋巴细胞百分比降低;PRO组相比于OVA组无明显差异。3.生命早期感染RSV成年后诱导哮喘的小鼠肺部炎症增强以及粘液分泌增多。肺组织HE染色结果显示,IRO组、NRO组和PRO组与OVA组相比,气管和血管周围炎症细胞浸润明显增加,三组RO组的炎症评分明显高于OVA组。肺组织PAS染色结果显示,IRO组、NRO组和PRO组气管周围的粘液分泌明显多于OVA组;三组RO组的PAS评分显著高于OVA组,且三组RO组肺中Muc5ac m RNA的表达也明显高于OVA组。4.生命早期感染RSV成年后诱导哮喘的小鼠肺、气管、肺门淋巴结和脾中相关细胞因子和趋化因子的m RNA表达情况:（1）在小鼠肺中,与OVA组相比,IRO组中eotaxin-1、eotaxin-2和IL-13的表达降低,CCL28、IL-17A、TSLP和IL-1β的表达升高;NRO组中eotaxin-1、eotaxin-2和IL-13的表达降低,CCL28、IL-17A的表达升高;PRO组中eotaxin-1、eotaxin-2的表达降低,CCL28、IL-17A、IFN-γ和IL-1β的表达升高。（2）在小鼠气管中,与OVA组相比,IRO组中eotaxin-1、eotaxin-2和IL-1β的表达降低;NRO组中eotaxin-2和IL-1β的表达降低,CCL28、IL-17A的表达升高;PRO组中eotaxin-2和IL-1β的表达降低,CCL28、IL-17A、TSLP和IL-5的表达升高。（3）在小鼠肺门淋巴结中,与OVA组相比,IRO组中IFN-γ的表达降低,CCL28的表达升高;NRO组中IL-13、IFN-γ和TNF-α的表达降低,CCL28和IL-17A的表达升高;PRO组中IL-5和IFN-γ的表达降低,eotaxin-1和eotaxin-2表达升高。（4）在小鼠脾中,与OVA组相比,IRO组中CCL28和IL-17A的表达升高;NRO组中IFN-γ的表达降低,CCL28、IL-17A、IL-5、IL-13和TSLP的表达升高;PRO组中IFN-γ的表达降低,eotaxin-2和TSLP的表达升高。5.生命早期感染RSV成年后诱导哮喘的小鼠BALF中CCL28和IL-17A的蛋白表达升高。ELISA检测结果显示,IRO组、NRO组和PRO组BALF上清液中CCL28和IL-17A的蛋白表达均高于OVA组。结论1.生命早期感染RSV成年后诱导哮喘能够导致小鼠肺部炎症增强。2.生命早期感染RSV成年后诱导哮喘的小鼠模型中CCL28可能发挥了趋化嗜酸性粒细胞的作用。3.IL-17A和CCL28的升高水平几乎一致表明在该实验模型中IL-17A可能刺激了CCL28的产生。