【目的】探讨半夏泻心汤改善2型糖尿病代谢性损伤的临床及实验研究以期增加半夏泻心汤的应用范围;同时,运用网络药理学技术分析半夏泻心汤治疗2型糖尿病的作用靶点和相关信号通路,进一步分析其防治2型糖尿病的理论基础和作用机制。通过临床试验和基础试验,验证中药复方对调节能量代谢通路、恢复糖脂代谢平衡,改善胰岛素抵抗的有效性。【方法】运用中药系统药理学分析平台(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of TCM,BATMAN-TCM)数据库获取半夏泻心汤的作用靶标基因,预测其可能的分子作用靶点。从OMIM、TDD疾病数据库收集2型糖尿病的靶标基因,将两者取交集后得运用STRING构建蛋白质间相互作用网络,并将结果用Cytospace进行网络可视化展示,通过R软件对交集基因进行G O富集分析和KEGG分子信号通路富集分析并将结果进行可视化展示。临床研究:釆用随机对照研究方法,收集成都中医药大学附属医院住院部及门诊2018年10月至2019年10月之间就诊的脾虚胃热型2型糖尿病病例,并按照随机分组(查随机数字表)的原则分别纳入对照组和治疗组。对照组按照原有既定的降糖西药治疗,治疗组在西药基础上联合半夏泻心汤治疗,疗程均为12周。基础研究:采用前期成熟的2型糖尿病造模方法,建立2型糖尿病动物模型。按体重将80只SD雄性大鼠随机分为正常组10只,模型组70只,造模成功的50只大鼠随机分为模型组(DM)、二甲双胍组(MET,0.16g·kg-1)、半夏泻心汤剂量组(BXD,6.98g·kg-1),NG和DM组则分别灌服同等体积的生理盐水,连续四周。选取生化法检测血清中空腹血糖、TC、TG含量;ELISA法检测血清中胰岛素、FFA、ADPN、TNF-α和IL-6含量及肝脏组织中SOD、GSH-Px、ATP、ATP/AMP含量。实时荧光定量(PCR)检测肝脏组织中AMPKαm RNA、SIRT1m RNA、PGC-1αm RNA、PPARαm RNA含量;免疫印迹法(Western blot,WB)观察肝脏组织中AMPKα、PGC-1α、PPARα、SIRT1表达情况;【结果】网络药理学半夏泻心汤的245个靶点基因中有11个靶点与2型糖尿病疾病相互关联,交集基因分别是PPARD、INS、TNF、SOD2、MTNR1B、KCNB1、SIRT1、GPBAR1、ADORA1、GHRL、AVPR2;临床试验共纳入病例56例,其中脱落3例,剔除3例;实际完成50例,其中治疗组组26例,对照组24例。两组患者年龄、性别等基线资料一致,具有可比性(P>0.05)。(1)治疗后,与对照组相比,FPG、2HPG的P值均小于0.05(P<0.05),Hb A1c、FINS、HOMA-IR的P值小于0.05(P<0.05),中医症状、体征积分P值小于0.01(P<0.01),差异有统计学意义;(2)治疗后,与对照组相比,TC与TG的P值均小于0.05(P<0.05),差异有统计学意义;(3)与对照组比较,治疗组中FFA、ADPN浓度明显降低,P值均小于0.05(P<0.05),差异有统计学意义。(4)与对照组比较,治疗组中IL-6、TNF-α含量明显下降,P值均小于0.05(P<0.05),差异有统计学意义。(5)治疗后,与对照组相比,治疗组中ATP浓度降低(P<0.05),差异有统计学意义,AMP/ATP的比值有降低趋势(P>0.05),差异无统计学意义。(6)治疗后,与对照组相比,治疗组中SIRT1、AMPKα、PGC-1α浓度降低(P<0.05),差异有统计学意义;基础试验1 T2DM大鼠模型的建立及对血糖影响(1)通过一般情况观察,与NG组相比,模型组大鼠活动不灵敏,体重降低,皮毛暗淡,饮食等摄入减少;(2)客观指标检测,模型组大鼠空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数水平明显升高(P<0.05);(3)经半夏泻心汤干预治疗后,模型组大鼠体重、精神状态,空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数均有所好转。2型糖尿病大鼠造模成功。2半夏泻心汤对DM大鼠血脂代谢的影响造模后,与NG组相比,DM组大鼠血清中TC、TG、FFA含量显著升高,而ADPN含量显著降低,差异均有统计学差异(P<0.01);与DM比较,药物干预组TC、TG、FFA含量均明显降低,ADPN含量有升高趋势,具有统计学差异(P<0.01或P<0.05)。其中BXD组变化较为显著,3半夏泻心汤对DM大鼠炎症因子、氧化应激的影响与NG相比,DM大鼠血清IL-6、TNF-α显著升高,显著升高有统计学差异(P<0.01);与DM比较,药物干预组大鼠血清IL-6、TNF-α下降趋势明显,具有统计学差异(P<0.01);与NG相比,DM组大鼠肝脏组织中GSH-Px、SOD有下降趋势,无统计学差异(P>0.05);与DM比较,药物干预组大鼠肝脏组织中GSH-Px、SOD有上升趋势,其中BXD组有统计学差异(P<0.05);4半夏泻心汤对DM大鼠AMPK信号通路中相关调节因子影响与NG相比,DM组大鼠肝脏组织中ATP、AMP/ATP含量明显降低,有统计学差异(P<0.01);与DM组比较,经药物干预后ATP、AMP/ATP有上升趋势(P>0.05)。与NG相比,DM组大鼠肝脏组织中SIRT1m RNA含量有下降趋势,无明显统计学差异(P>0.05),AMPKαm RNA、PPARαm RNA含量明显降低(P<0.01),PGC-1αm RNA含量升高,具有统计学意义(P<0.05);与DM组相比,药物干预组大鼠肝脏组织中SIRT1m RNA、AMPKαm RNA、PPARαm RNA含量均有上升趋势,有统计学差异(P<0.05)。PGC-1αm RNA含量有下将趋势,其中MET组有统计学差异(P<0.05);与NG相比,DM组大鼠肝脏组织中AMPKα、PPARα蛋白表达无明显差异,不具备统计学意义(P>0.05),PGC-1α蛋白表达升高,具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);SIRT1蛋白表达明显降低,具有显著的统计学意义(P<0.05);与DM组相比,药物干预组大鼠肝脏组织中PGC-1α蛋白表达明显降低,具有显著的统计学意义(P<0.05或P<0.01)。SIRT1、PPARα蛋白表达有上升趋势无明显差异,不具备统计学意义(P>0.05)。【结论】(1)网络药理学方法科学分析半夏泻心汤的基因表达,调节炎症因子、氧化应激、糖脂代谢、能量代谢,影响胰岛素与其受体结合,诱导SIRT1(沉默信息调节因子2相关酶1)表达,从而激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路,调节能量代谢的开放,促进糖脂代谢和线粒体的生物合成来增强胰岛素敏感性。阐释中医药多靶点、多通路防治2型糖尿病的治疗优势,为后续的实验研究提供研究方向和理论参考。(2)2型糖尿病患者和大鼠可导致糖脂代谢紊乱、炎症及氧化应激损伤,引发能量代谢失衡,其中DM组大鼠胰腺组织、肝脏组织可见较多炎性细胞浸润及脂肪变性且肝脏组织的脂滴比率显著升高;(3)半夏泻心汤能降低2型糖尿病患者和大鼠血糖,降低胰岛素抵抗指数,改善胰岛素抵抗,下调IL-6、TNF-α的含量,调控促炎因子的水平,增强机体对胰岛素的敏感性,降低ADPN含量,激活AMPK系统,增加了机体对FFA消耗,降低了TC、TG的水平,减轻胰岛素抵抗,从而发挥降脂作用;同时半夏泻心汤可以上调2型糖尿病患者和大鼠AMP/ATP比值,激活AMPK/SIRT1/PGC-1α系统,使ATP含量增加,从而促进机体糖异生、脂肪酸氧化和线粒体的生物合成来增强抗炎、抗氧化和调节能量代谢能力。(4)半夏泻心汤通过激活DM大鼠PGC-1α下游分子PPARα抑制脂肪酸氧化,降低脂肪酸含量,抑制促炎因子,降低SOD和GSH活性,达到减轻大鼠肝细胞氧化应激损伤及脂质蓄积,发挥改善IR作用,从而恢复糖脂代谢水平。(5)结合本实验的研究,我们认为“脾不散精”的关键在于“脾主运化”功能失司,而其中“脾主化”可能起着主要作用。