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研究背景:由于具有肿瘤抗原特异性等优势,TIL细胞过继转移治疗被认为是最具发展前景的免疫治疗方法之一。尽管细胞过继转移治疗已经在多种肿瘤的治疗上取得了很多突破性进展,但机体内肿瘤的“免疫逃逸”现象严重影响治疗效果,仍是肿瘤免疫治疗中函待解决的一个重要问题。Treg细胞是具有免疫调节功能的一类T细胞亚群,在肿瘤免疫中能够抑制机体的抗肿瘤免疫应答从而降低免疫治疗效果。所以,如何消除Treg的免疫抑制作用一直是免疫治疗研究中的热点和难点。Helios(IKZF2)是Ikaros转录因子家族的一员,研究发现其与控制Treg发育和免疫抑制功能的FoxP3转录因子关系密切,同时发现Treg细胞内部表达高水平的Helios蛋白就能够保持免疫抑制性,而缺少Helios蛋白会造成Treg细胞表型不稳定,引起FoxP3表达下降,进而无法提供免疫抑制效果。因此我们考虑可以通过设计构建针对Helios基因的shRNA慢病毒载体,利用慢病毒载体介导的RNA干扰技术沉默Helios基因,靶向切断Treg细胞的肿瘤免疫抑制因素,增强TIL细胞的抗肿瘤免疫应答。研究目的:建立从恶性腹水中高效分离TIL细胞和肿瘤细胞的方法,设计构建针对Helios基因的shRNA慢病毒载体。应用shHelios慢病毒转染TIL细胞,干预Treg数量和功能,探究干扰Helios表达对TIL细胞体外及体内特异性抗瘤活性的影响。研究方法:1)制备健康志愿者和胃癌患者PBMC,从恶性腹水中分离TIL细胞和自体肿瘤细胞,并进行体外活化扩增。流式细胞术检测对比PBMC和TIL细胞亚群特征以及经体外活化扩增前后TIL细胞表型情况,LDH检测其对自体和异体肿瘤细胞的杀伤活性。2)设计构建针对Helios基因的shRNA慢病毒载体,明确转染TIL细胞最佳MOI值,筛选出沉默Helios效果最佳慢病毒。3)shHelios慢病毒应用纤粘连蛋白-离心法转染TIL细胞;荧光显微镜观察shHelios慢病毒感染细胞的能力;流式细胞术检测TIL细胞表型;ELISA检测TIL分泌的IFN-γ、TGF-β、IL-10 以及 IL-35。4)LDH 释放法检测 blank-TIL、negative-TIL、和shHelios-TIL对自体肿瘤细胞的的体外杀伤能力;利用裸鼠皮下瘤动物模型比较不同组TIL细胞体内抗肿瘤作用。研究结果:1)本实验成功建立从恶性腹水中高效分离并经体外培养活化扩增TIL细胞和自体肿瘤细胞的技术方法;TIL细胞中CD4+T细胞和Treg细胞升高,同时CD8+/Treg比值下降(均P<0.05);HLA-DR在初始分离TIL细胞中表达阳性比例明显升高(P<0.05);TIL细胞对自体肿瘤细胞有明显的特异性杀伤作用。2)设计合成的干扰片段成功连接入了双酶切线性化的表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,转染至293T细胞制备慢病毒符合实验用滴度;确定感染TIL细胞最佳MOI=150;筛选出沉默效果最佳慢病毒pLKD-CMV-eGFP-U6-5160,命名为 pLKD-eGFP-shHelios。3)与 blank-TIL 和 negative-TIL 组相比,shHelios-TIL 组Helios 和 FoxP3mRNA 表达显著降低(均 P<0.05);Helios 在 CD3+CD4+FoxP3+细胞中表达阳性的比例明显降低(P<0.05);shHelios-TIL组CD8+T细胞比例升高,CD3+CD4+FoxP3+Treg 细胞比例明显降低(均 P<0.05);shHelios-TIL 组 IFN-γ 含量升高,TGF-β和IL-10含量降低(均P<0.05);LDH检测结果显示shHelios-TIL组对自体肿瘤细胞的特异性杀伤作用更强(P<0.05);本实验成功构建小鼠皮下瘤模型,结果显示shHelios-TIL组经尾静脉注射抗肿瘤作用最强,较blank-TIL和negative-TIL对照组能更显著的抑制肿瘤生长(P<0.01)。研究结论:1)相对于PBMC,初始分离TIL细胞中存在大量HLA-DR表达阳性激活的效应T细胞,同时Treg比例升高,CD8+/Treg比值下降,存在明显免疫抑制因素;TIL细胞对自体肿瘤细胞具有显著的特异性杀伤活性。2)慢病毒pLKD-eGFP-shHelios采用纤粘连蛋白-离心法转染TIL细胞,可有效干扰Helios表达,干预Treg细胞数量与功能,显著增强TIL细胞的体外及体内特异性抗肿瘤活性,可以做为治疗胃癌伴发恶性腹水的新策略。