阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种多发于老年期和老年前期的中枢神经系统退行性疾病,其主要病理学改变包括弥漫性大脑萎缩、β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques,SP)、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)和大量的神经元丢失。患者典型的临床症状为进行性记忆障碍和认知功能减退。伴随社会老龄化的进程,AD的发病率逐年上升,已成为严重危害人类健康的医学和社会问题。目前AD的病因和发病机制尚不十分清楚。大量研究表明,多种因素所导致的小胶质细胞激活引发的脑内炎症反应在AD的发生发展中扮演着重要的角色。活化的小胶质细胞可产生大量的细胞毒性物质,如一氧化氮、炎性因子、兴奋性氨基酸、活化氧自由基等,这些细胞毒性物质参与了神经元的退变过程,而抑制小胶质细胞活化的药物具有神经保护作用。因此以小胶质细胞为靶标,抑制其激活及炎性因子产生已成为AD防治药物开发领域的热点之一。CA4-3是从中医传统名方六味地黄汤(Liuwei Dihuang Decoction,LW)中提取的活性成分,具有调节免疫功能的作用。芍药苷是当归芍药散(Danggui shaoyao San,DSS)的活性成分之一。我室的前期研究工作表明,灌胃给予LW对快速老化模型小鼠SAMP8的学习记忆功能具有明显改善作用,对海马和皮层中多种炎性因子基因的异常表达亦具有明显调节作用,提示LW很可能具有改善脑内紊乱的免疫炎性反应的作用。临床实验证实DSS对中、重度AD患者有一定的治疗作用,主要表现为改善AD患者的运动障碍和认知功能下降。动物实验表明,DSS可改善多种痴呆模型鼠的学习记忆行为。细胞实验表明,DSS对Aβ诱导的皮层神经元和PC12细胞损伤具有保护作用。我室前期研究结果也表明,DSS对SAMP8的空间学习记忆(Morris水迷宫实验)和被动回避学习记忆(跳台实验)能力的下降具有明显改善作用。体外实验表明DSS的活性成分芍药苷能够影响Aβ聚集,并且对聚集的Aβ具有解聚的作用。为探讨CA4-3和芍药苷在AD模型上是否具有抗炎活性,本研究首先比较了几种常见的小胶质细胞激活剂,如聚集态的Aβ25-35、Aβ1-42、LPS及IFN-γ等对小胶质细胞激活的影响,优化建立了LPS致小胶质细胞激活的模型,并在此模型上观察了CA4-3、芍药苷等对小胶质细胞激活及炎性因子释放的影响。此外,通过腹腔注射LPS建立了小鼠神经炎性反应的动物模型,在此模型上观察了LW抗LPS致小鼠神经炎性反应的作用。最后我们对LW、CA4-3、芍药苷抗神经炎性反应的机制做了初步探讨。一、不同激活剂对小胶质细胞的活化作用1、小胶质细胞的培养选择两种小胶质细胞,包括小鼠小胶质细胞系BV-2细胞和原代培养的大鼠小胶质细胞。研究结果表明,LPS等激活剂可使BV-2细胞激活,细胞形态从枝状转变为阿米巴样,并且细胞体积增大,呈活化状态。在小胶质细胞的原代培养实验中,应用利多卡因进行小胶质细胞的分离纯化。与传统的机械振摇法和低浓度胰蛋白酶消化法相比,应用利多卡因分离纯化原代培养小胶质细胞的操作步骤更简单,能够去除星形胶质细胞和少突胶质细胞的污染,特异性更高。2、Aβ对小胶质细胞的活化作用Aβ对小胶质细胞的激活作用与其聚集状态密切相关,因此本研究首先采用透射电镜对不同聚集状态Aβ形态进行了观察。结果表明,新鲜配制的Aβ以无定形结构存在,没有明显的聚集,电子密度较低,未见纤维结构形成;而经过老化聚集的Aβ以淀粉样纤维结构为主,纵横交错,呈针状或晶状聚集。进而观察聚集态Aβ25-35、Aβ1-42对小胶质细胞活力、炎性细胞因子mRNA和蛋白表达的影响,考察Aβ对小胶质细胞的激活作用。结果表明,聚集态Aβ25-35在1~10μM浓度范围内对BV-2细胞活力无明显影响,聚集态Aβ1-42在5、10μM浓度时对BV-2细胞活力具有抑制作用。聚集态Aβ25-35在25、50μM浓度时对原代培养小胶质细胞活力产生明显地抑制作用。聚集态Aβ25-35在25μM时可显著提高BV-2细胞炎性因子IL-1β、iNOS和TNF-αmRNA的表达水平。聚集态Aβ25-35(10~100μM)和Aβ1-42(10μM)对BV-2细胞分泌TNF-α具有明显促进作用,10μM的聚集态Aβ1-42诱导BV-2细胞激活后使其分泌TNF-α的含量增加了近1倍。进一步研究表明,上述两种聚集态Aβ片段诱导BV-2细胞分泌TNF-α的作用随时间延长而明显增加。同样,聚集态Aβ25-35在25、50μM浓度时对原代培养小胶质细胞分泌TNF-α亦具有明显促进作用。上述结果表明,聚集态Aβ25-35和Aβ1-42对小胶质细胞具有明显活化作用。3、LPS对小胶质细胞的活化作用LPS是革兰氏阴性细菌死亡或解体后释放出来的一种具有内毒素活性的物质,是一种重要的巨噬细胞激活剂。小胶质细胞是脑内的巨噬细胞,本研究中,我们观察了LPS对小胶质细胞的激活作用,旨在建立一种稳定可靠的、可用于小胶质细胞激活抑制剂筛选的细胞模型。首先观察了LPS对小胶质细胞系和原代培养小胶质细胞活力的影响,结果表明,LPS在0~2.5μg/ml浓度范围内,对BV-2细胞活力无明显影响,浓度升高至5μg/ml时可明显抑制其活力。而LPS在0~5μg/ml浓度范围内对原代培养小胶质细胞活力均无明显影响。进而观察了LPS对小胶质细胞炎性细胞因子mRNA表达的影响,结果表明,LPS能不同程度上调BV-2细胞炎性因子IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA水平,其中,LPS在0.1~5μg/ml浓度范围内能明显上调IL-1βmRNA的表达水平,且浓度为2.5μg/ml时的作用最为明显。LPS在1μg/ml浓度时对iNOS和TNF-αmRNA表达水平的上调作用最为明显。最后观察了LPS对小胶质细胞炎性细胞因子的影响,结果表明,LPS在0.5μg/ml浓度时即可明显地诱导BV-2细胞产生并释放炎性细胞因子TNF-α,而在0.5~5μg/ml浓度范围内,其诱导BV-2细胞分泌TNF-α的作用具有明显的浓度依赖性。进一步研究表明,LPS作用于BV-2细胞6小时即可观察到TNF-α分泌水平的明显增高,随时间延长,TNF-α分泌水平进一步增高,在所观察的48小时范围内,具有明显的时间依赖性。在原代培养的小胶质细胞上,同样可观察到1~5μg/ml的LPS对TNF-α分泌的促进作用,但无明显的浓度依赖关系。4、IFN-γ及其与Aβ合用对小胶质细胞的活化作用IFN-γ也是一种重要的小胶质细胞激活剂,且有文献报道,其可与Aβ协同作用,共同激活小胶质细胞。因此我们观察了IFN-γ单独使用及其与Aβ合用对小胶质细胞活力与分泌炎性因子的作用。实验结果表明,IFN-γ在10~50pg/ml浓度范围内对BV-2细胞活力有明显的抑制作用,Aβ25-35在20~100μM浓度范围内对BV-2细胞活力有明显的抑制作用。Aβ25-35在20~100μM浓度条件下与50pg/ml IFN-γ合用可明显的抑制BV-2细胞的活力,但与单独应用IFN-γ50pg/ml组相比无明显差异,提示Aβ25-35与IFN-γ合用对细胞活力的影响仅为二者相加,未显示出协同效应。IFN-γ在25~100pg/ml时可浓度依赖地诱导BV-2细胞分泌TNF-α。聚集态Aβ25-35与IFN-γ联合应用也可浓度依赖地诱导BV-2细胞分泌炎性因子TNF-α,且IFN-γ浓度在25pg/ml同Aβ25-35浓度为20、50?M联合应用时,作用强度大于单独应用,显示出明显明显协同效应。上述结果表明,Aβ、LPS及IFN-γ等激活剂能够诱导小胶质细胞活化,同时增加了小胶质细胞炎性因子基因水平和蛋白水平的表达,提示激活剂能够同时影响小胶质细胞的转录和翻译水平,均可做为小胶质细胞激活模型的激活剂。但LPS激活的小胶质细胞模型量效、时效关系明显,线性范围宽、成本低等优点,可能是一个更为稳定、实用的小胶质细胞激活模型,可做为进行小胶质细胞激活抑制剂筛选和相应机制研究的首选细胞模型。二、LW活性组分及DSS活性组分对小胶质细胞激活的影响1、LW全方含药血清对小胶质细胞激活的影响我室前期研究表明LW对SAMP8海马和皮层中多种炎性因子基因的异常表达具有明显调节作用,在此基础上,本课题首先应用血清药理学实验方法,观察了LW全方含药血清对LPS诱导小胶质细胞分泌TNF-α的影响。结果表明,2.5~10% LW全方含药血清能够抑制小胶质细胞炎性因子TNF-α的释放,提示LW含药血清中含有抑制小胶质细胞激活的活性物质,可能具有抗神经炎性反应的作用。2、LW活性组分对小胶质细胞激活的影响在LW全方含药血清实验结果的基础上,我们观察了LW活性组分LW B-B、LW D-b、CA-30及活性成分CA4-3对小胶质细胞激活的影响。结果表明,LW B-B、LW D-b、CA-30及CA4-3在0.1~100μg/ml浓度范围内对BV-2细胞活力有一定的抑制作用。CA4-3在0.1~100μg/ml浓度范围内对LPS诱导小胶质细胞分泌TNF-α具有抑制作用,提示CA4-3是LW中具有抑制小胶质细胞激活的活性物质之一,因此也可能是LW中具有抗神经炎性反应的物质之一。3、DSS活性组分对小胶质细胞激活的影响以往文献报道和我室前期研究结果表明,DSS具有抗AD和影响Aβ聚集的作用。在此基础上,本课题观察了DSS活性部位JD-30和活性成分芍药苷对小胶质细胞激活的影响。结果表明,JD-30在12.5~200μg/ml浓度范围内,芍药苷在6.25~100μg/ml浓度范围内对BV-2细胞活力有一定的抑制作用,JD-30仅对原代培养小胶质细胞分泌TNF-α具有明显抑制作用,芍药苷则对两种小胶质细胞分泌TNF-α均具有明显抑制作用。提示JD-30和芍药苷可能通过抑制小胶质细胞激活发挥抗神经炎性反应的作用。三、小鼠神经炎性反应模型的建立及LW抗神经炎性反应的作用1、小鼠神经炎性反应模型的建立侧脑室注射Aβ是制备AD动物模型的一种方法。本课题采用昆明种小鼠侧脑室注射Aβ的方法制备Aβ相关神经炎性反应AD动物模型,采用跳台实验、避暗实验和Morris水迷宫实验测定动物学习记忆能力的变化,采用ELISA方法测定脑内炎性细胞因子水平的变化。结果表明,侧脑室注射Aβ25-35(10μM/只)后小鼠跳台实验错误次数明显增多,提示动物学习记忆能力降低。但动物脑内炎性因子水平没有明显变化,这可能与测定时Aβ25-35已被代谢清除,其所致的脑内神经炎性反应已经减轻或消退有关。由于Aβ的致炎作用不够强,用于制备小鼠神经炎性反应模型难度较大,因此我们选择LPS作为造模药物。侧脑室注射LPS(5μg/只)后,小鼠脑内炎性因子水平没有明显改变。将LPS(1mg/kg)给药方式改为腹腔注射后,小鼠血清炎性因子含量、皮层和海马内炎性因子含量及mRNA水平显著升高,提示LPS腹腔注射可建立小鼠神经炎性反应模型。2、LW抗LPS诱导小鼠神经炎性反应的作用我室前期研究结果表明,LW具有改善免疫功能的作用,对多种原因所致的学习记忆功能障碍均具有改善作用,且对Aβ及TNF-α等炎性细胞因子所致的神经元离子通道异常及神经突触可塑性的损害具有不同程度调节或改善作用,提示通过调节机体免疫功能抑制神经炎性反应可能是LW发挥上述作用的基础。本课题观察了LW对小鼠神经炎性反应的影响,结果表明口服LW能够降低腹腔注射LPS诱导的小鼠血清中TNF-α的水平;中、高剂量LW(10和20 g/kg)能降低LPS诱导的小鼠皮层和海马中炎性因子mRNA表达。提示LW对LPS诱导的小鼠神经炎性反应具有明显抑制作用。四、LW及DSS活性组分或成分抗小胶质细胞激活机制的初步研究在上述研究结果的基础上,我们对LW及DSS活性成分抗小胶质细胞激活的机制进行了初步研究。结果表明,LPS能够诱导BV-2细胞NF-κB的表达和p38MAPK的磷酸化水平升高,CA4-3(1~100μg/ml)及芍药苷(50μg/ml)对这两种变化具有明显的抑制作用。口服LW能够降低腹腔注射LPS诱导的神经炎性反应模型小鼠海马和皮层p38MAPK磷酸化水平。结果提示,LW及DSS活性成分CA4-3及芍药苷抑制小胶质细胞的活化,降低炎性因子的表达可能是通过降低NF-κB的表达和p38MAPK磷酸化水平而实现的。通过以上研究,本论文主要得到以下结论:1.激活剂LPS、IFN-γ及聚集态Aβ可显著提高BV-2细胞炎性因子的表达。非聚集态的Aβ不能够激活小胶质细胞。LPS激活的小胶质细胞模型是进行小胶质细胞激活抑制剂筛选和相应机制研究的首选细胞模型。2. LW含药血清、LW活性成分CA4-3和DSS的活性部位JD-30、及其活性成分芍药苷具有抑制小胶质细胞激活的作用。3. LPS腹腔注射可制备小鼠神经炎性反应模型。口服LW能够降低该模型动物血清、皮层和海马内炎性因子水平。4. LW能够通过MAPK信号通路抑制神经炎性反应。CA4-3和芍药苷能够通过降低NF-κB的表达和p38MAPK的磷酸化水平抑制小胶质细胞的激活,降低其炎性因子的表达,从而达到抗神经炎性反应的作用。