论文部分内容阅读
氧化应激是一种机体氧化还原失衡的非正常生理状态,与人体健康有直接或间接的关系。黄酮类化合物大多具有抗氧化活性,具有保护细胞抵御氧化损伤的作用。黄酮类物质的广泛存在性及人类饮食结构的多样性,决定了摄入机体的黄酮类物质的多元性,其健康效应机制的发挥被认为是多种活性成分交互作用的结果,多种黄酮类物质较单一成分往往具有更强的生理作用和更小的剂量效应,呈现出协同增效的作用。因此,阐明黄酮类物质协同增效的机制更能反应其在生物体内发挥生理功能的实际情况。本研究选择槲皮素、儿茶素这两种食品中分布广泛且含量丰富的黄酮类化合物为研究对象,以H2O2损伤的HepG2细胞为氧化应激模型,系统分析了槲皮素与儿茶素的协同抗氧化作用。细胞生物学行为实验表明,槲皮素与儿茶素具有协同抗氧化应激的作用;为了分析其内在分子机制,我们利用全转录组高通量测序技术,结合生物信息学分析方法对两种活性成分协同抗氧化作用的潜在分子靶点（包括miRNA和mRNA）进行初步预测,通过基因功能、通路富集、差异表达和miRNA-mRNA互作分析等技术对相关靶点进一步筛选和确认;后续选择差异显著的具有较高研究价值的分子靶点和信号通路进行验证,从miRNA角度阐明槲皮素与儿茶素在转录后水平协同调控氧化应激的分子机制。主要研究结果如下:（1）构建H2O2（500μM）诱导的HepG2细胞氧化应激损伤模型,从细胞生物学行为方面探讨槲皮素与儿茶素对氧化应激损伤的协同保护效应。结果显示,槲皮素与儿茶素联合使用（12.5μM+12.5μM）能显著逆转由H2O2氧化损伤引起的细胞存活率的降低、细胞中活性氧簇（ROS）的过量累积以及脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量升高,且作用效果显著强于槲皮素（25μM）或儿茶素（25μM）单独使用,从而表明槲皮素与儿茶素联用能够协同增强H2O2损伤的HepG2细胞抗氧化应激功能。（2）采用基于illumina高通量测序平台进行全转录组测序,通过生物信息学分析不同处理组间:空白对照组（Control）、过氧化氢处理组（H2O2）、槲皮素25μM处理组（Quer）、儿茶素25μM处理组（Cat）、槲皮素和儿茶素联用12.5μM+12.5μM处理组（QC）的表达差异。通过重点分析Quer、Cat、QC三组间miRNA以及mRNA的表达差异,从基因和转录后水平揭示槲皮素与儿茶素协同抗氧化作用的多靶点、多途径的网络式调控模式。Quer vs Cat vs QC比较组GO功能注释和KEGG通路富集分析显示,差异表达基因与差异表达miRNA主要参与了细胞内遗传物质、信号通路、细胞生命进程等相关调控,多富集到癌症、炎症、心血管等氧化损伤相关疾病通路,细胞自噬、细胞凋亡等细胞调节进程,涉及的信号转导途径多与炎症反应、细胞氧化还原稳态调节、细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤形成等关联较大。结合差异表达miRNA、mRNA聚类分析以及miRNA-mRNA互作网络分析寻找到差异表达较显著、在miRNA-mRNA互作网络中参与度较多的BACH1和let-7家族作为槲皮素与儿茶素协同抗氧化应激的潜在靶点。（3）槲皮素、儿茶素联用下BACH1的表达特性及协同抗氧化应激功能分析。槲皮素与儿茶素能协同下调BACH1基因的mRNA和蛋白表达水平。槲皮素与儿茶素联用能够协同促进Nrf2的表达及核转位,进而启动下游II相解毒酶HO-1、NQO1的高效表达。进一步对BACH1的生物学功能及具体作用机制研究结果显示,抑制BACH1不仅促进了Keap1-Nrf2抗氧化信号通路中关键基因的表达,提高了细胞存活率并且减少细胞中ROS的累积,而且消除了槲皮素与儿茶素之间的协同作用,从而证实BACH1是协同作用中不可替代的关键调控节点。以上表明槲皮素与儿茶素通过协同抑制BACH1,从而激活Keap1-Nrf2信号通路,起到保护细胞抵御氧化损伤的效应。（4）调控BACH1的miRNA筛选、验证及功能分析。通过生物信息学预测、过表达/抑制miRNA试验和双荧光素酶报告基因试验证实BACH1是let-7a-5p和miR-25-3p的靶基因。与单一miRNA作用相较,let-7a-5p与miR-25-3p同时过表达细胞能显著抑制BACH1的转录和翻译过程,证明二者之间存在交互作用,能协同靶向BACH1。同时抑制let-7a-5p和miR-25-3p表达显著降低了细胞存活率、诱导细胞中ROS的积累,miRNA的共同抑制作用并未显著改变槲皮素与儿茶素在细胞活力和ROS水平上的协同效应,我们推测有其他miRNA共同参与调节了BACH1的表达。此外,过表达let-7a-5p和miR-25-3p能显著抵消上调BACH1引起的细胞活力降低、ROS水平升高等细胞生理变化,从而进一步证实这两个miRNA是通过直接靶向抑制BACH1,对细胞抗氧化功能起到正向调节作用。（5）Let-7靶向调控基因及相关信号通路分析。通过生物信息学预测发现let-7a-5p还可靶向调控CHUK。结合课题组前期研究成果,进一步采用RNAi抑制CHUK表达发现,细胞存活率显著上升而ROS显著降低,并且槲皮素与儿茶素在这两个水平上的协同效应均丧失,证明CHUK在协同调控机制中扮演了重要的角色。过表达/抑制miRNA试验和双荧光素酶报告基因检测结果证实CHUK是let-7a-5p的靶基因。（6）针对已明确的协同抗氧化机制的两条调控途径Keap1-Nrf2与NF-κB,通过生物信息学预测两条通路中主要调控因子的潜在靶点miRNA,并通过交集分析筛选出可能连接两条信号途径的miRNA,从转录后水平探讨这两条信号通路的互调作用,初步构建miRNA介导槲皮素与儿茶素协同保护细胞抗氧化应激的调控网络。结果显示,除已明确的let-7a-5p外,miR-155-5p、miR-23-3p、miR-9-5p、miR-125-5p、miR-128-1-5p、miR-15-5p/16-5p/195-5p/424-5p/497-5p均可同时参与调节两条通路的主要信号因子,Maf、MafK、BACH1和IKKβ、CHUK都含有与其他通路两个以上的共同靶点miRNA,这些miRNA和基因很可能是Keap1-Nrf2与NF-κB信号途径互作网络中关键节点,它们之间可能通过相互作用共同参与构建槲皮素与儿茶素协同保护细胞抗氧化应激的调控网络,对维持细胞氧化还原稳态起重要作用。