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IKKβ是一种重要的Set/Thr蛋白激酶,能被多种致胰岛损伤和引起胰岛素抵抗的因素激活,从而引起β细胞损伤和胰岛素抵抗。因此,通过应用IKKD特异抑制剂可能具有防止Ⅰ型DM的发生及预防和治疗Ⅱ型DM的胰岛素抵抗的作用。目前,由于IKKβ的特异性抑制剂阿斯匹林或水杨酸钠有明显的胃肠道和耳毒性等副作用,限制了其临床应用。因此,研究IKKβ的特异性抑制剂将有很好的临床应用前景。另外,进一步研究IKKβ引起胰岛素抵抗具体机制,对阐明胰岛素抵抗的发生机制和寻找新的治疗靶点具有重要意义。此外IKKβ与其他疾病特别是慢性炎症疾病、癌症等疾病也相关。PKCθ也是一种重要的Set/Thr蛋白激酶,是蛋白激酶C家族成员,也能被多种引起胰岛素抵抗的因素激活,从而引起胰岛素抵抗。因此,通过应用PKCθ特异抑制剂可能具有治疗Ⅱ型DM的胰岛素抵抗的作用。目前,由于PKCθ的特异性抑制剂还没有筛选到,限制了其临床应用。更为重要的是,PKCθ基因敲除小鼠是正常和可生育的,并且不影响胸腺的正常发育。这给我们重大的启示:虽然PKCθ在除胸腺外的其他组织中也表达,但它的功能也许是冗余的,那么PKCθ的特异性抑制剂对其他组织的毒性不会很大,所以,PKCθ的特异性抑制剂成药的可能性很大。因此,研究PKCθ的特异性抑制剂将有很好的临床应用前景。另外,进一步研究PKCθ引起胰岛素抵抗具体机制,对阐明胰岛素抵抗的发生机制和寻找新的治疗靶点具有重要意义。此外,PKCθ与T淋巴细胞瘤相关,是治疗T淋巴细胞瘤的潜在靶点。本文的研究内容包括用PCR方法以含IKKβ全长基因序列的cDNA为模板,采用:PCR方法分别扩增得到约2. 2 kb的IKKβFL(IKKβ Full Length)和0. 9 kb的IKKβ KD(IKKβ Kinase Domain)大小的DNA片段。利用了杆状病毒-昆虫表达系统(Invitrogen BAC to BAC),把IKKβ FL/KD克隆到该系统专用表达载体pFastBacl上,把目的基因克隆到pFastBacl的位于杆状病毒特异启动子之后的多克隆位点获得重组质粒pFastBac1-IKKβ FL/KD,把重组质粒转化到DH10Bac高效感受态细胞(含有帮助质粒,野生型Bacmid)中,在帮助质粒(表达转座酶的质粒)的作用下,重组质粒中的目的基因发生转座,从而,插入了野生型的Bacmid(即杆状病毒穿梭载体)中,形成重组Bacmid。由于外源基因的插入,打断了lacZα基因,所以用蓝白斑筛选白色克隆。挑单克隆划线验证确实为白色克隆后,再用PCR验证,确定