研究背景:神经胶质瘤是颅内最常见的原发肿瘤类型,是一系列起源于神经胶质细胞的异质性神经肿瘤的统称。多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是最常见的也是恶性程度最高的胶质瘤亚型。GBM呈高度侵袭性生长,侵入脑实质的肿瘤细胞难以在手术和后续的放射治疗/替莫唑胺(temozolomide,TMZ)为主的化疗中彻底清除,这是导致GBM高复发、预后极差的主要原因之一。因此,建立良好的实验研究模型,进而分离出侵袭性胶质瘤细胞,研发针对侵袭性肿瘤细胞的新型靶向药物具有实质上的临床转化意义。利用体外肿瘤细胞培养模型探讨胶质瘤细胞的侵袭及其机制是常见的实验室方法,其中包括划痕实验、细胞外基质凝胶实验(transwell侵袭实验、3D肿瘤球微侵袭实验等)及细胞在脑切片上迁移模型实验等。然而,肿瘤的侵袭迁移是一个非常复杂的动态过程,受到多种内外因素的影响,主要包括肿瘤细胞自身变化以及肿瘤细胞所生存的环境即肿瘤肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)变化的影响。TME主要由肿瘤间质、临近的各种组织细胞、微血管、多种免疫细胞和免疫分子等组成。肿瘤微环境中的多种细胞构成了肿瘤间及肿瘤内细胞的异质性,从而影响肿瘤的恶性增殖、侵袭浸润及血管生成等。研究表明,癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)能够诱导乳腺癌细胞上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和肿瘤干细胞表型,显著促进乳腺癌的侵袭及转移;我们课题组研究发现CAFs可以通过反Warburg效应,直接影响结直肠癌的新陈代谢过程,从而促进肿瘤的恶性增殖及侵袭转移。在针对胶质瘤微环境的研究发现,反应性胶质瘤相关星形胶质细胞通过高表达链接蛋白Connexin43显著促进了胶质瘤细胞的侵袭;胶质瘤相关小胶质细胞(巨噬细胞,glioma associated macrophages,GAMs)与胶质瘤免疫抑制微环境的形成密切相关,从而导致对抗肿瘤药物的耐药性增强。因此,肿瘤微环境对胶质瘤的发生发展、侵袭转移以及对药物的反应性至关重要。然而,传统的体外模型不具有与肿瘤微环境中其他组分的相互作用条件,难以反映体内脑环境的复杂结构和功能特点。通过 IVYGAP 项目(http://glioblastoma.alleninstitute.org),可获得超过 40 个GBM的RNA-Seq数据,其中已从不同的区域(包括胶质瘤中心区和胶质瘤微环境浸润区)收集了病理学组织样本,但组织病理学难以从肿瘤微环境中的反应性胶质瘤相关神经胶质细胞中筛选出肿瘤细胞,故不能确切标记侵袭性肿瘤细胞。因此,我们需要建立可靠的体外模型来模拟脑肿瘤的侵袭,其肿瘤细胞可以侵入成熟分化的脑组织结构,并利用此模型实现实时、靶向地对侵袭性胶质瘤细胞的形态学、基因组学以及蛋白组学进行评估。基于此,本论文首先构建了可模拟脑肿瘤微环境的类脑器官模型,详细探讨了其发育为成熟类脑器官结构的过程;其次,建立了病人来源的原代胶质母细胞瘤spheroids模型与类脑器官模型的体外共培养系统,应用共聚焦显微镜可以实时追踪荧光标记的胶质瘤细胞在共培养系统类脑器官中的运动,进而确定肿瘤细胞的侵袭速度、侵袭能力;第三,利用共培养系统,我们甄别筛选出靶向的胶质瘤治疗药物苦参碱,并探讨了药物的治疗效果及作用机制。第一部分 新型体外类脑器官模型建立目的构建类脑器官模型并详细评估各种神经细胞谱系分化发育为成熟脑结构的过程。方法1.体外分离妊娠1 8天的大鼠胚胎的神经干细胞,分化培养为类脑器官。2.采用蛋白质印迹法(western blotting,WB)检测不同发育阶段(第4天、第10天、第14天和第21天)类脑器官中神经干细胞标记物(Nestin、SOX2)、成熟神经元标记物(NeuN)、星形胶质细胞标记物(GFAP)、少突胶质细胞标记物(MBP,Oligo2)和小胶质细胞标记物(CD11b,AIF-1)表达情况。3.苏木素伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色和免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测不同发育阶段的类脑器官的结构变化和成熟神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞的表达以及分布情况。4.透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscopy,TEM)分析21天的类脑器官的神经元发育状态。5.RNA-seq及蛋白质朴分析评估类脑器官的发育过程,并与诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,IPSc)起源的类脑器官发育以及数据库中鼠脑体内发育过程进行对比分析。结果1.WB显示类脑器官发育过程中神经干细胞标记物(Nestin,SOX2)明显下调;成熟神经元标记物(NeuN)、星形胶质细胞标记物(GFAP)、少突胶质细胞标记物(MBP)和小胶质细胞标记物(CD11b,AIF-1)明显上调,其中21天的类脑器官表达量最高。2.H&E染色结果显示21天的的类脑器官具有明显的结构分区:白质区和灰质区。3.IHC结果显示21天的类脑器官中不同的细胞定位:星形胶质细胞主要分布在白质区和表层区;神经元主要分布在灰质区;小胶质细胞散在分布在灰质区和表层区;少突胶质细胞分布在表层区。21天的类脑器官呈现高度的结构整合特征。4.TEM结果显示21天的类脑器官含有许多神经突触和髓鞘轴突。5.在转录组水平上,大鼠类脑器官的发育与体内大鼠脑的发育表现出强烈的相似性,其中基因表达相关性分析显示21天的类脑器官与产后体内发育21的大鼠脑组织具有明显的一致性,表明21天的类脑器官为发育成熟的类脑器官。6.与转录组学相比,蛋白质组学分析在分化过程中揭示了与其相似的表达演变模式。7.蛋白质组学比对分析发现4个月的IPSc起源的类脑器官与第10天的大鼠类脑器官发育度相似。表明4个月大的IPSc类脑器官仍代表发育中的大脑结构,与产后第10天的大鼠体内大脑发育更相似,大鼠类脑器官是比IPSc类脑器官发育成熟速度快,是构建方法简单快捷的类体内模型。结论成功构建了可反应体内脑发育成熟的体外类脑器官模型,并深入探讨了类脑器官的发育成熟过程,为脑发育及脑肿瘤研究提供了较好的体外研究模型。第二部分新型类脑器官模型在胶质母细胞瘤研究中的应用目的构建类脑器官模型与病人来源的原代胶质母细胞瘤spheroids模型共培养系统,研究胶质瘤侵袭特征及筛选靶向药物。方法1.使用GFP慢病毒标记实验室构建的5种病人来源的胶质瘤细胞系(BG5,BG7,P3,GG16,GG6)。2.使用圆底低贴附96孔培养板培养肿瘤细胞为肿瘤spheroids,并将其与类脑器官共培养。3.Confocal共聚焦显微镜实时观察GFP标记的胶质瘤细胞的侵袭情况。4.使用Imaris软件追踪每一个侵袭性胶质瘤细胞的运动轨迹,并计算其侵袭速度。5.裸鼠颅脑原位种植5种病人来源的胶质瘤细胞系,每天检测裸鼠体重,体重下降20%以上时麻醉老鼠,4%多聚甲醛灌注后取出脑组织,石蜡包埋切片,H&E染色检测不同肿瘤细胞系的侵袭特点。6.研究表明TGFβ抑制剂可以增强GBM中的抗迁移/抗侵袭和抗血管生成的作用。本课题在共培养系统中加入TGFβ因子、TGFβ抑制剂,验证其对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。7.利用共培养系统筛选实验室在研药物(苦参碱Matrine;阿苯达唑Albendazole,ABZ;替莫唑胺TMZ和硫哒嗪thioridazine,Thio)对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。结果1.不同的胶质瘤细胞系具有不同的侵袭能力和侵袭速度。实验室构建的GFP标记的5种病人来源的胶质瘤细胞系中,BG5具有最高的侵袭能力,最快的侵袭速度,P3次之,BG7、GG16细胞系侵袭能力及侵袭速度中等,而GG6细胞系侵袭能力微弱。2.H&E染色结果显示体内颅脑原位种植瘤的侵袭能力强弱与共培养模型中得到的侵袭能力结果相似。表明体外共培养模型可以完全模拟体内脑肿瘤侵袭进展过程,而且更直观。3.TGFβ可以明显促进共培养样系统中胶质母细胞瘤BG7细胞的侵袭,而TGFβ抑制剂可以显著抑制胶质母细胞瘤BG7细胞的侵袭。表明体外共培养模型可以用来探讨细胞因子以及药物对胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的影响。4.在共培养系统中替莫唑胺、苦参碱可以显著抑制胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力,苦参碱可能为治疗胶质母细胞瘤的潜在药物。结论成功构建了类脑器官模型与病人来源的原代胶质母细胞瘤spheroids模型的共培养系统,探讨了不同胶质母细胞瘤细胞系的侵袭能力,验证了 TGFβ及TGFβ抑制剂对胶质母细胞瘤侵袭能力的影响。确定了共培养系统可以高度模拟体内模型,能够提供针对侵入性GBM的潜在治疗策略的实验室研究依据。我们利用此共培养系统筛选出胶质瘤的可能的潜在靶向治疗药物苦参碱。第三部分苦参械对胶质母细胞瘤的治疗作用及机制研究目的进一步确定苦参碱对胶质母细胞瘤的治疗作用,并阐明其潜在作用机制。方法1.使用Cellcountingkit-8(CCK-8)检测苦参碱对正常神经胶质细胞及多种胶质瘤细胞系的毒性作用,进一步明确药物的安全作用浓度。2.应用EdU增值实验探讨苦参碱对胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响。3.利用划痕实验、transwell侵袭实验,进一步验证苦参碱对胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的抑制作用。4.应用PI和V-FITC染色,流式细胞仪检测苦参碱诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡情况。5.应用TUNNEL染色法检测苦参碱诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡情况。6.应用PI染色,流式细胞仪检测苦参碱对胶质母细胞瘤细胞周期的影响。7.使用γH2AX免疫荧光染色检测苦参碱诱导胶质母细胞瘤细胞DNA损伤情况。8.应用SA-β-gal衰老染色试剂盒检测苦参碱诱导胶质母细胞瘤细胞衰老情况。9.WB探讨苦参碱不同时间处理胶质母细胞瘤细胞后,凋亡相关蛋白(PARP,Cleaved PARP,Caspase 3,Cleaved Caspase-3)、周期相关蛋白(Rb,p53,p21,p27,CKD4,CDK6)以及通路相关蛋白表达情况。10.蛋白质芯片、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)、数据库分析以及siRNA转染实验验证苦参碱作用于胶质瘤细胞的作用机制。11.使用立体定向仪,裸小鼠原位种植生物素标记的胶质瘤细胞系(U251、P3),从第三天开始起隔天腹腔注射PBS、苦参碱(40 mg/kg)、苦参碱(80 mg/kg)。小动物成像仪每周检测颅内肿瘤生长情况;每天检测裸鼠体重,体重下降20%以上时麻醉老鼠,4%多聚甲醛灌注后取脑,脑组织石蜡包埋切片,应用IHCKi67、γH2AX、p27染色探讨苦参碱对胶质母细胞瘤体内增殖和衰老的影响。结果1.苦参碱可以明显抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖。1.1 CCK-8结果显示,随着苦参碱处理细胞浓度的增加和处理时间的延长,细胞活性呈显著的梯度降低。胶质母细胞瘤细胞系在72小时的IC50值比正常胶质细胞NHA小约1.5至2倍,表明肿瘤细胞比正常胶质细胞对苦参碱更加敏感。1.2 EdU结果显示,苦参碱处理的胶质母细胞瘤细胞EdU阳性细胞数显著减少。2.划痕实验和transwell侵袭实验结果显示,苦参碱可以明显抑制胶质瘤细胞的侵袭。3.苦参碱不能诱导胶质母细胞瘤细胞的凋亡,但可以诱导胶质母细胞瘤细胞的衰老。3.1流式细胞仪、TUNNEL染色检测细胞凋亡以及凋亡相关蛋白WB结果显示,苦参碱处理的胶质母细胞瘤细胞与对照组无明显差异。3.2周期结果显示,苦参碱介导胶质母细胞瘤G0/G1期周期阻滞。3.3苦参碱处理胶质母细胞瘤细胞后,yH2AX免疫荧光染色阳性细胞数显著增加,诱导了胶质母细胞瘤细胞DNA损伤。3.4 SA-β-gal衰老染色结果显示,苦参碱处理组胶质母细胞瘤细胞SA-β-gal染色阳性细胞数明显增多,诱导了胶质母细胞瘤细胞的衰老。4.WB结果、以及siRNA转染实验表明苦参碱通过上调p27诱导胶质母细胞瘤细胞的衰老。5.数据库分析及WB结果表明苦参碱抑制了 PI3K/AKT/p27信号通路。6.蛋白质芯片、Elisa分析显示苦参碱处理的胶质瘤细胞IGF1分泌减少,WB结果显示下调IGF1可以抑制PI3K/AKT/p27信号通路,β-gal衰老染色结果显示IGF1的下调可增强苦参碱诱导的胶质瘤细胞的衰老作用。7.体内实验验证了苦参碱通过诱导胶质母细胞瘤细胞的衰老进而起到对胶质瘤的抑制作用。7.1小动物成像结果显示,苦参碱处理组裸鼠颅内肿瘤体积较对照明显减小。7.2小鼠Kaplan-Meier生存曲线分析显示,苦参碱可以延长胶质母细胞瘤裸鼠的生存期。7.3 IHC结果显示苦参碱处理组肿瘤组织中Ki67阳性细胞数较对照组减少,而γ-H2AX、p27阳性细胞数较对照明显增加。结论苦参碱可以通过抑制IGF1/PI3K/AKT/p27信号通路诱导胶质母细胞瘤细胞的衰老,进而抑制胶质瘤细胞的恶性增殖及侵袭转移。