植食性动物胃肠道中存在丰富的与木质纤维素降解有关的酶类,但不同动物之间存在差异。滇金丝猴是我国I类重点保护动物,为典型植食性灵长类动物,由于摄食种类和物种的差异,其胃肠道中可能蕴含有不同于其它动物的新型微生物木聚糖酶基因资源。本文结合传统纯培养和宏基因组学技术,从滇金丝猴粪便微生物中获取丰富的木聚糖降解酶基因,为新型木聚糖酶的开发和滇金丝猴胃肠道微生物资源的利用奠定基础,并为滇金丝猴胃肠道中木质纤维素的降解机理研究提供理论依据。研究结果总结如下:1.以野生和半圈养滇金丝猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,GH10木聚糖酶简并引物扩增木聚糖酶基因片段构建文库。从野生和半圈养滇金丝猴粪便微生物克隆文库中分别获得26、28条GH10木聚糖酶基因片段,与GenBank中木聚糖酶序列一致性分别介于58%–95%、63%–81%之间。比对分析发现,两种环境中的GH10木聚糖酶基因都来源于未培养细菌、厚壁菌门、拟杆菌门,其中Bacillus、Bacteroides、Butyrivibrio来源的GH10木聚糖酶基因只存在野生滇金丝猴克隆文库,而Paludibacter、Roseburia来源的GH10木聚糖酶基因只存在半圈养滇金丝猴克隆文库。2.通过培养和免培养技术,从滇金丝猴粪便微生物中获得丰富的木聚糖降解酶基因,其中XynRBM26和XynRBM为编码第10家族的木聚糖酶,XylRBM26为编码第43家族的木糖苷酶。三个基因与已知基因的相似性为55%–84%,说明其为新颖糖苷水解酶基因,分析发现XylRBM26具有两个结构域,为木糖苷酶结构与功能的研究提供了实验材料。3.上述三个基因经原核表达、纯化后研究其酶学特性发现:a.XynRBM26最适pH为5.5,在pH 5.0–7.0之间具有良好的稳定性;最适温度为45℃,50℃时半衰期大于1 h;在5M的NaCl条件下活性保持在86%;此外,该酶对胰蛋白酶有较好的抗性,在饲料行业中有一定应用潜力。b.XynRBM最适温度为50℃,在0℃、10℃下酶活分别为13.5%、46.9%;50℃耐受60 min,活性仍保持95%以上;添加胰蛋白酶放置1 h酶活达120%;能水解燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖,4-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside、4-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside。该酶在水产养殖中具有一定的应用潜力,且能为底物特异性与木糖苷酶的结构研究提供良好的模型材料。c.XylRBM26最适温度为50℃,50℃下半衰期大于1 h;500 mM的木糖条件下剩余酶活50%;具有较好的NaCl、Pb2+、Ca2+抗性;能将木二糖、木三糖、木四糖降解为木糖。该酶在耐Pb2+、耐Ca2+机制研究方面具有一定理论价值,同时在木糖生产和海产品加工方面具有潜在应用价值。