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一、研究背景*越来越多的研究表明,胶质细胞激活是神经病理性疼痛的充分和必要条件。补体蛋白作为胶质细胞合成分泌的重要物质,在中枢系统疾病发挥不可或缺的作用。关于补体活化在神经病理性疼痛发病机制中的作用,目前鲜有研究。2005年美国著名学者Milligan等研究中发现,鞘内注射可溶性补体受体1可逆转神经病理性疼痛模型动物的痛觉过敏,从一定程度上反映了补体蛋白可能参与NPP的发生和发展。但是NPP时脊髓背角补体是否发生异常活化?补体表达有无规律?Milligan并无研究。二、目的本研究观察坐骨神经慢性压迫性损伤诱发NPP模型大鼠脊髓背角补体C3变化,采用补体抑制剂-眼镜蛇毒因子干预NPP模型大鼠脊髓补体表达,观察它对大鼠痛阈的影响,进而探讨脊髓补体异常活化在NPP形成中的作用。三、方法实验分三部分:1.大鼠CCI模型的制作及行为学评估SD大鼠36只,分为假手术组(sham组,n=12)、传统坐骨神经结扎组(传统CCI组,n=12 )和改良坐骨神经结扎组(改良CCI组,n=12 ),观察处理后2w内自发痛、触诱发痛及热刺激痛觉过敏等行为学变化;2.神经病理性疼痛大鼠脊髓背角补体C3mRNA及蛋白的表达SD大鼠84只,均分为7组,分别为正常对照组、假手术组1、3、7d组及坐骨神经结扎后1、3、7d组,每组12只。按照分组在规定时间测定热痛阈值和机械痛阈值后处死大鼠,采用RT-PCR技术测定L4-6脊髓中补体C3mRNA水平;免疫组化测定L4-6脊髓背角补体C3阳性细胞情况;免疫比浊法测定脊髓匀浆补体C3浓度。3.眼镜蛇毒因子对神经病理性疼痛大鼠模型的干预效应SD大鼠48只,分为假手术+生理盐水组(A组,n=12,在术前和术后每日持续尾静脉注射生理盐水)、CCI+生理盐水组(B组,n=12,在术前和术后每日持续尾静脉注射生理盐水)、CCI+CVF组(C组,n=12,在术前和术后每日持续尾静脉注射CVF50ug/kg)和CCI+生理盐水+CVF组(D组,n=12,在术后第4天尾静脉注射CVF50ug/kg,其余时间给予同等容量的生理盐水),分别在术前和术后1、3、7、14天观察大鼠自发痛及机械刺激痛觉过敏等行为学变化,两周后处死大鼠,用免疫组化测定大鼠脊髓背角补体C3阳性细胞情况,免疫比浊法测定脊髓中补体C3浓度,透射电镜观察背角神经元内部结构,分光光度法测定脊髓中SOD和MDA。四、结果1.传统CCI组和改良CCI组术后均出现结扎侧患足足趾并拢屈曲,外翻,称防御姿势。自发性痛行为评分:假手术组大鼠姿势、步态均为0分,传统CCI组大和改良CCI组大鼠评分均在2～4分。与假手术组相比,传统CCI组和改良CCI组术后均出现热痛阈值和机械诱发痛阈值降低现象;与传统CCI组相比,改良CCI组痛过敏稳定、持久,自噬现象较传统CCI组少。2.CCI大鼠坐骨神经结扎侧后1、3、7天脊髓背角补体C3蛋白及mRNA都显著表达,并呈进行性升高趋势,而假手术组无明显变化;Pearson相关分析显示,CCI大鼠脊髓背角补体异常活化状况与大鼠痛觉过敏程度相关。3.单次尾静脉注射CVF可一过性提高模型大鼠痛觉阈值,并随着药物的代谢作用逐渐减弱;持续给予CVF可抑制大鼠痛觉过敏的发生;脊髓匀浆SOD和MDA测定结果显示:与A组,相比,B组大鼠脊髓匀浆中SOD活力降低,MDA产物含量增多;与B组相比,C组大鼠脊髓匀浆中SOD活力升高,MDA产物含量下降。透射电镜观察,B组大鼠脊髓背角神经元内线粒体肿胀,核膜损伤;与B组相比,C组大鼠脊髓背角神经元线粒体肿胀程度明显减轻。五、结论1.改良CCI模型可以产生明显的、稳定的自发性疼痛和诱发性疼痛等类似临床神经痛的症状和体征。2.外周神经损伤诱发的NPP模型脊髓背角发生补体异常活化,补体活化程度与痛觉过敏的形成规律基本一致。3.干预脊髓背角补体的活化可以明显抑制或逆转痛觉过敏,提示脊髓背角补体异常活化在NPP的发生发展中发挥重要作用。