目的压疮(pressure ulcer,PU)是临床常见的并发症之一,也是治疗和护理的难题,一旦发生,不仅增加患者的痛苦,加重原发疾病,延长病程,严重可因继发感染而危及生命。其形成是多因素参与的复杂过程,其中压力是发生压疮最重要的危险因素,局部组织受压引起毛细血管血流不畅,血液回流受阻,进而导致组织的供氧和营养缺乏,当受压组织恢复血液灌流后又发生缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)。虽然目前对脑以及心肌等缺血再灌注损伤的研究较为深入,但迄今为止,压疮骨骼肌的缺血再灌注损伤的机制尚不十分明确,因此阐明压疮发生缺血再灌注损伤的机制,探讨有针对性的防治措施,减轻或避免缺血再灌注损伤的发生,是防治压疮的关键。在压疮的缺血再灌注期,受压组织大量释放的自由基会加重组织损伤,因此对自由基的检验可以验证缺血再灌注损伤的发生以及严重程度。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是内源性生物合成酶,依据NOS基因在染色体上的定位不同,分为3种亚型:神经元型一氧化氮合酶(neuronal NOS,nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(edothelial NOS,eNOS)。其中nNOS和eNOS又称为结构型NOS(constitutive nitricoxide synthase,cNOS)其表达依赖Ca~+和钙调蛋白(CaM),是骨骼肌在生理状态下存在并表达的酶,由其产生的一氧化氮(nitric oxide,NO)主要发挥神经递质和第二信使作用;iNOS是在损伤、缺血、炎症介质、内毒素等病理因素的刺激下被激活,其活性不依赖Ca~+和CaM,合成大量具有细胞毒性作用的NO,参与介导免疫反应,可引起细胞和组织的损伤。组织缺血缺氧后,线粒体合成ATP减少,ATP依赖的离子泵衰竭,细胞内钙超载,黄嘌呤氧化酶系统活化,花生四烯酸所引起的链式反应激活,产生大量的自由基。NO也称氮氧自由基,可以通过多条通路参与缺血再灌注损伤的发生;超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)是体内重要的过氧化物酶,能及时清除可能产生的氧自由基,保护细胞免受氧化性损伤,其活性可反映机体清除氧自由基的能力;丙二醛(malondialdehyde,MDA)是氧自由基作用于生物膜多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的产物,其产生量与氧自由基的量相平衡,因而测定其含量可以反映组织中含有氧自由基的水平和组织内脂质过氧化的情况。研究资料表明缺血再灌注损伤参与压疮的形成,但压疮形成过程中自由基的产生机制及其在压疮形成过程中的作用尚不清楚。为此,本研究采用外加物理压力作用于大鼠肢体复制大鼠压疮模型,观察肢体受压后不同时间点iNOS在骨骼肌中的表达情况以及血清中NO、SOD、MDA的含量变化,旨在验证缺血再灌注损伤发生时自由基参与骨骼肌损伤的过程,探讨自由基参与压疮发生的机制。材料和方法一、压疮大鼠模型制备与动物分组健康纯系Wister大鼠(中国医科大学实验动物中心提供)54只,雌雄不限,体重180～220g。随机分为1个对照组和8个实验组,每组6只。10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后,使大鼠仰卧固定于大鼠固定板上,用一重量为0.56kg的钢柱垂直施压于大鼠左后肢,主要受压的肌肉为股内收肌和耻骨肌,钢柱和肢体的接触面积为直径1cm的圆形表面,受压部位单位面积承受的压力为70kPa,施压5h。对照组动物麻醉后仰卧固定于大鼠固定板上5h。实验组和对照组大鼠造模后解除固定,常规单只分笼饲养。实验组动物根据肢体受压5h后放松的时间不同共分为8组,分别编号为再灌注组(IR组):IR0h组、IR4h组、IR12h组、IR24h组、IR3d组、IR1w组、IR2w组、IR4w组。实验组大鼠分别在施压5h后,再灌注0h、4h、12h、24h、3天、1周、2周、4周时,取左后肢施压部位的股内收肌置于4%多聚甲醛中固定后转入30%蔗糖溶液中脱水,OCT常规包埋,冰冻切片机连续切片;另一部分新鲜受压部位骨骼肌,液氮速冻后于-70℃保存,备用做Western-blot检验骨骼肌中iNOS的表达。各组大鼠取腹主动脉血液,离心后取血浆,-70℃冰箱保存备用,用721型分光光度计,根据试剂盒操作规程检测血清中SOD、NO、MDA的水平。对照组大鼠同法取材处理。二、压疮大鼠骨骼肌组织的变化观察1、对实验组大鼠骨骼肌进行HE染色,以观察肢体受压后不同时间点骨骼肌的结构改变。2、提取各组大鼠血清,采用硝酸还原酶法测定NO含量、黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力、硫代巴比妥法测定MDA含量。3、应用免疫组织化学染色方法观察肢体受压后不同时间点iNOS在大鼠骨骼肌中的分布和表达。4、蛋白质免疫印迹(Western-blot)方法检测大鼠骨骼肌中iNOS的表达情况。结果1、对照组骨骼肌纤维形态正常,结构完整。实验组大鼠骨骼肌的发生进行性损伤:出现肌纤维水肿、横纹消失、空泡变、溶解、断裂等变化。以缺血再灌注24小时最重,表现为肌纤维高度水肿,大量骨骼肌纤维空泡变、溶解、断裂;在IR 1周、IR 2周组可见骨骼肌水肿逐渐减轻,至缺血再灌注4周,组织损伤仍未完全修复,仍可见大量溶解、断裂的骨骼肌,大部分骨骼肌横纹消失。2、随着再灌注时间的延长,血清中SOD活力呈现先降低后升高的变化:从解除压力后4h逐渐降低,至第3天降至最低,然后逐渐升高,至2周时,仍显著低于对照组(P<0.05),IR4w组SOD活力恢复正常;血清MDA的含量表现为先升高后降低:从解除压力后0h即显著升高,IR3天组MDA的含量最高,然后逐渐下降,至解除压力后4周大鼠的血清中MDA含量和对照组相比仍然具有显著差异(P<0.05);血清NO的含量表现为先升高后降低:从0h开始升高,其中IR12h组中NO的含量最高,然后逐渐降低,至2周时,仍显著高于对照组(P<0.05),IR4周组NO含量恢复正常。3、iNOS免疫组化切片显示,在IR4h组、IR 12h组、IR 24h组、IR 3天组有大量iNOS阳性表达的骨骼肌纤维,iNOS的表达水平显著高于对照组(P<0.05)。4、Western-blot方法检测出,IR4h组、IR 12h组、IR 24h组、IR 3天组中iNOS的表达水平明显增加(P<0.05);组间比较发现:IR12h组和IR0h组、IR 4h组、IR1周组、IR2周组相比iNOS的表达水平高,差异具有显著性(P<0.05);IR24h组和IR0h组、IR 4h组、IR 3天组、IR1周组、IR2周组相比iNOS的表达水平高,差异具有显著性(P<0.05);IR4周组和IR3天组、IR4h组、IR12h组、IR24h组相比iNOS的表达水平低,差异具有显著性(P<0.05)。结论1、缺血再灌注损伤参与压疮的形成,血清SOD活力和MDA含量的时相变化呈负相关性。2、压疮大鼠骨骼肌的损伤程度与血清中NO、MDA的含量以及组织中iNOS的表达呈正相关。iNOS活化是压疮缺血再灌注损伤过程中自由基氧化损伤的重要环节。