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植物在受到镉、铝等金属离子胁迫后,会产生一些应激机制来缓解镉、铝等的毒害,最为典型的是植物可以通过细胞壁的阻隔作用减少其进入细胞内,或将进入细胞内的离子隔离到非代谢的细胞器。本文以拟南芥和与细胞壁组分相关的突变体为研究材料,深入研究了葡萄糖及木葡聚糖对拟南芥抗镉和铝毒害中的贡献以及对进入细胞内的镉和铝的可能去向进行了探讨,最后对参与初生细胞壁,同时也是半纤维素主要组分β(1-4)-木葡聚糖的裂解和聚合的木葡聚糖内源转糖基酶/水解酶(XTH15和XTH31)的作用特性进行了系统分析。得到以下主要结果: 1.外源葡萄糖提高拟南芥耐镉能力的作用机制研究 葡葡糖不仅影响植物的生理与发育,同时也参与了植物对非生物胁迫的响应。我们发现,镉胁迫下,添加外源葡葡糖能促进拟南芥根与地上部的生长,增加根部镉积累量,同时显著降低了镉从根向地上部的转运,从而缓解了镉胁迫引起的失绿症状。通过测定镉在根系不同细胞壁组分中的分布,发现半纤维素1中的镉含量最高,而添加外源葡葡糖不影响根系细胞壁中果胶及其吸持镉的量,但能显著增加半纤维素1及其吸持镉的量;此外,对分离的根系原生质体进行LeadmiumTM Green染色表明,添加外源葡葡糖能促进更多的镉储存到液泡中,这一结果与液泡膜定位的能转运镉的相关基因(MTP1,MTP3,NAS1和NAS2)的表达上调相一致。上述研究结果证明,外源葡萄糖一方面通过增加镉在细胞壁的固定,另一方面增加了进入细胞内的镉在液泡中的分隔化,两者共同作用减少了镉向地上部分的转运及其对细胞的毒性。 2.XTH15提高拟南芥耐铝性的可能机制 在前期研究中,发现铝胁迫下伴随着拟南芥根系XTH14, XTH15和XTH31表达量的下降,木葡聚糖内源转糖基酶(XET)活性明显下降。本研究中,对其中的XTH15的定位和功能进行了探讨。结果表明,XTH15基因突变后,虽然根系中铝含量与野生型无明显差异,但其抗铝性却明显得到增强;此外,XTH15突变后,根尖XET活性没明显变化,但铝处理后,其XET活性明显高于野生型;组织表达定位显示,XTH15在根尖特别是伸长区表达,亚细胞定位表明其潜在的位于N端、由30个氨基酸组成的信号肽锚定在细胞质膜上;与细胞壁吸持铝下降相对应的是,突变体中铝耐性的提高与参与将进入根系细胞内的铝从铝毒害敏感部位转运到非敏感部位的ALS3基因表达增强,从而达到缓解细胞内铝毒害的目的。 3.拟南芥XTH15和XTH31的酶学特性研究 在拟南芥中XTH蛋白由33个基因家族成员所编码。前期研究中发现铝胁迫下根系XTH15和XTH31基因均明显下调,但这两个基因分别属于XTH基因家族的不同亚家族。为此,对通过酵母异源表达得到的XTH15和XTH31蛋白进行了系统的酶学特性研究。XTH15,是一个典型的group-ⅡXTH成员,体外检测表明具有高XET活性却几乎没有XEH活性,其XET酶活Km值为31μM XXXGol(受体底物)及2.87mg/ml木糖葡聚糖(供体底物),表现出了对受体底物较强的偏好。对之相对应的,XTH31,是一个group-Ⅲ-A XTH成员,体外检测表明具有以XEH酶活为主且有少量XET活性的特性。其XET酶活Km值为86μM XXXGol(受体底物),此以水解酶为主的蛋白对转糖基作用的受体底物表现出了较弱的偏好,而其XEH酶活的Km值为1.64mg/ml木糖葡聚糖(供体底物),表现出了较强的偏好。XTH31的XET酶活对木糖葡聚糖非还原端第三位残基被替换成Gal或Fuc-Gal影响不明显,但如果第二位与第三位木糖残基都被替换成Gal或Fuc-Gal的话,其活性被显著抑制。相比之下,XTH15的XET酶活能耐受这些木糖葡聚糖残基被替代。这两种酶也显示了不同的pH偏好,XTH31表现出的最适pH很低。在质外体pH6.2-4.5的范围内,XTH31的水解酶XEH活性随着pH的降低而几乎呈线性增加,与可能的“酸生长”作用相一致。综上所述,与其他拟南芥XTH家族相比,这两种受铝胁迫抑制的XTHs酶在各个重要的酶特性方面各具特性。