随着工业的迅速发展,迄今为止已有大约10万种化学品进入人类的日常生活。人们在生产和生活中接触的许多种化学品都会影响人类的生殖功能,使人类的生育能力特别是精子的质量和数量发生显著改变。外来化学品所造成的生殖损伤日益受到人们的重视。三氯异氰尿酸(Trichloroisocyanuric acid,TCCA)是一种新型、高效、广谱、低毒、性质稳定、效力持久、使用方便的消毒剂、漂白剂和防腐剂,广泛应用于饮食、医疗、卫生、农业、渔业、纺织、造纸等行业。国内外对TCCA的相关研究报道较少,仅有少量关于TCCA对单种生物的毒性研究,而其对人类生育能力的危害性尚未见到文献报道。本研究以SPF级别SD大鼠为研究对象,通过TCCA较低剂量(0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1)经口喂饲24月、较高剂量(96.5、193mg/kg)灌胃染毒10天和高剂量(275、550mg/kg)灌胃染毒10周三个实验,观察TCCA对雄性SD大鼠睾丸结构及功能的影响,明确TCCA对雄性SD大鼠生殖系统的损伤,从而确定TCCA的生殖毒性；采用免疫组织化学SABC法检测睾丸内凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax、Caspase-3、FasL/Fas蛋白的表达；采用实时荧光定量PCR法检测睾丸内Bcl-2 mRNA和Fas mRNA|的表达水平；采用原子吸收光谱法检测睾丸内锌、.钙、铜的含量。通过这一系列的检测,较为深入的研究TCCA对SD大鼠睾丸毒性效应的作用机制,为进一步阐述TCCA的毒性作用机制奠定基础。本研究的主要方法和结果：1.TCCA对大鼠一般状态的影响：在0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1剂量水平下连续染毒24个月,大鼠的一般状况与对照组相比均未见明显不同。在96.5、193mg/kg剂量水平下,染毒4天后大鼠出现活动减少,喜弓背行走,精神低靡的现象,但整个实验期间未出现大鼠的死亡。在275、550mg/kg剂量水平下,大鼠染毒后立即表现得比较烦躁,对外反应敏感,背部向上呈弯弓状,活动明显加强,好打斗；染毒4小时后大鼠活动明显减少,反应迟钝。染毒5周后,大鼠整日活动少或无活动,多以卧位为主,行动迟缓,进食量明显减少,毛发无光泽。染毒第9天开始出现大鼠的死亡,死亡大鼠肛周、唇部有血性分泌物。以上实验结果提示：SD大鼠的一般状况(行为活动、饮食、生存、异常表现)随染毒剂量水平的高低明显不同。染毒剂量越高,毒性反应越明显,大鼠死亡出现的时间也越早。2. TCCA对大鼠体重、生殖器官重量的影响在0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1剂量水平下连续染毒24个月,TCCA对各剂量组雄性SD大鼠的生长体重无明显影响,而对睾丸重量、睾丸脏器系数有明显影响。各剂量组的睾丸重量分别为3.009±1.206g、3.175±1.281g、3.232±1.800g,均低于对照组睾丸重量4.828±0.799g(P<0.001)。各个剂量组睾丸脏器系数分别为2.144±0.855、2.326±0.862、2.342±1.225,均低于对照组睾丸脏器系数3.603±0.462(P<0.001)。在96.5、193mg/kg剂量水平下,4和12周龄大鼠的体重增长均受到抑制；193mg/kg剂量水平下,4周龄大鼠睾丸重量(1.15±0.25g)和睾丸脏器系数(7.47±0.98)均低于对照组睾丸睾丸重量1.44±0.12g和睾丸脏器系数8.58±0.78(P<0.05)。在275、550mg/kg剂量水平下,TCCA可明显抑制大鼠体重,大鼠睾丸重量分别为3.40±0.44g、3.29±1.07g,均低于对照组睾丸重量3.58±0.62g(P<0.05)。以上结果提示：随着TCCA染毒水平的增加,其对大鼠体重增长出现抑制作用,染毒水平越高,体重抑制现象越明显；长期接触较低浓度的TCCA或短期接触较高浓度的TCCA,均可降低睾丸重量,染毒水平越高,睾丸的重量减轻越明显。3. TCCA对睾丸曲细精管直径的影响在7.59mg·kg-1·d-1剂量水平下连续染毒12个月,SD雄性大鼠睾丸曲细精管直径为193.69±36.91μm,明显低于对照组大鼠睾丸曲细精管直径239.89±42.1μm(P<0.001)。在96.5、193mg/kg剂量水平下,4周龄大鼠睾丸曲细精管直径分别为167.30±12.55、144.23±11.35μm,明显低于对照组大鼠睾丸曲细精管直径183.82±20.36μm(P<0.01)；12周龄大鼠睾丸曲细精管直径分别为327.9±30.3、325.9±40.9μm,明显低于对照组大鼠睾丸曲细精管直径338.2±54.5μtm(P<0.01)。以上结果提示：在一定剂量水平下,TCCA可使大鼠睾丸曲细精管变得细小,染毒水平越高,曲细精管越细小4. TCCA对大鼠睾丸组织形态学的影响在7.59mg·kg-1·d-1剂量组连续染毒12个月时,大鼠睾丸出现曲细精管萎缩、睾丸体积减小、精子弥漫性生成障碍等病变,对照组睾丸未检及以上病变。在0、0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1剂量水平下染毒24个月时,各个剂量组各60例大鼠中,精子生成障碍分别为9、16、24、31例,曲细精管萎缩分别为12、16、23、32例,睾丸体积减小分别为8、15、20、31例,附睾腔内无精子分别为6、13、17、32；经统计分析,2.29、7.59mg·kg-1·d-1剂量组上述病理改变发生率均明显增高(P<0.001),说明在2.29、7.59mg-kg-1·d-1的剂量水平下,长期摄食TCCA会明显损伤大鼠睾丸的结构,影响精子形成,从而累及附睾内无精子,提示TCCA对雄性大鼠生殖系统表现出较为明显的毒性作用,主要的靶器官为睾丸。在96.5、193mg/kg剂量水平下连续染毒10天,4周龄大鼠睾丸出现生精细胞退化(生精细胞核固缩)增加的现象,12周龄大鼠睾丸出现部分曲细精管生殖细胞层次紊乱、生精细胞脱落、支持细胞核空泡化、长形精子细胞退化等病理改变,且染毒水平越高,病理改变越明显。在275、550mg/kg剂量水平下连续间隔染毒10周,大鼠睾丸出现曲细精管的局灶性、弥漫性萎缩以及个别曲细精管管腔不规则、支持细胞胞浆空泡化及间质细胞增生等病理改变,且染毒水平越高,病理改变越明显。在193mg/kg剂量水平下连续染毒10天,TCCA可引起4、12周龄大鼠睾丸精原细胞核超微结构的改变,具体表现为：核膜的破损、核变形、染色质浓染等,但精原细胞未见明显的凋亡小体和坏死,也未见到其他细胞器在超微结构上的明显改变。5. TCCA对大鼠睾丸细胞凋亡相关蛋白表达的影响在275mg/kg剂量水平下,连续10周间隔染毒TCCA,采用免疫组织化学的SABC方法检测SD大鼠睾丸中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Fas、FasL、Caspase-3的表达情况,结果如下：Bcl-2阳性表达指数对照组为67.97%,275mg/kg剂量组为48.75%,Bcl-2表达降低(P<0.001); Bax阳性表达指数对照组为58.99%,275mg/kg剂量组为45.70%,Bax表达降低(P<0.001)；对照组睾丸曲细精管Bcl-2/Bax蛋白阳性表达的比值为1.15,275mg/kg剂量组Bcl-2/Bax比值为1.06,二者比值降低(P<0.05); Fas阳性表达指数对照组为82.31%,275mg/kg剂量组为78.46%,Fas表达指数无明显差异,但275mg/kg剂量组Fas表达强度明显增强；FasL阳性表达指数对照组为53.79%,275mg/kg剂量组为76.05%,FasL表达增加(P<0.001); Caspase-3阳性表达指数对照组为50.81%,275mg/kg剂量组为57.83%,Caspase-3表达降低(P<0.05)。在275mg/kg剂量水平下,连续10周间隔染毒TCCA,采用荧光实时定量PCR的方法检测睾丸内Bcl-2和Fas mRNA表达水平,结果发现：对照组Bcl一2 mRNA相对表达数为0.062±0.015,275mg／kg剂量组相对表达数0.192±0.053,Bcl-2 mRNA表达明显升高(P<0.01)；对照组Fas mRNA相对表达数为0.072±0.005,275mg／kg剂量组相对表达数0.090±0.012,Fas mRNA表达明显升高(P<0.05)。本次研究表明,TCCA可通过降低Bcl一2／Bax蛋白比值及增加Fas. FasL的表达,启动外源性、内源性凋亡途径,激活下游的效应Caspase-3,促使睾丸细胞凋亡的发生从而引起生精细胞脱落、数量减少,最终引发精子生成障碍、曲细精管萎缩。6. TCCA对大鼠睾丸锌、钙、铜含量的影响在275.550mg/kg剂量水平下,连续10周间隔染毒TCCA,采用原子吸收光谱法检测睾丸内锌、钙、铜的含量,结果发现：275.550mg/kg剂量组大鼠睾丸内钙含量分别为16.66±8.85 mg／kg.14.42±8.67 mg／kg,均低于对照组大鼠睾丸内钙的含量18.36±7.52mg/kg,但差异无统计学意义；275.550mg/kg剂量组大鼠睾丸内锌的含量分别为24.00±5.70 mg／kg.22.83±2.59mg／kg,均低于对照组睾丸锌含量24.41±7.88 mg／kg,其中550mg/kg剂量组大鼠翠丸锌含量降低有统计学意义(P<0.05)；275、550mg/kg剂量组大鼠睾丸内铜的含量分别为1.99±0.37 mg／kg.1.59±0.46mg/kg,均低于对照组睾丸锌含量2.03±0.87mg／kg,其中550mg/kg剂量组大鼠睾丸铜含量降低有统计学意义(P<0.05)。7. TCCA对大鼠精子质量的影响在96.5 mg/kg.193mg/kg剂量水平下12周龄成年大鼠连续10天染毒TCCA,通过检测附睾内精子数量、精子活动率及精子形态,评价TCCA对大鼠精子质量的影响。实验结果发现：对照组、96.5 mg/kg.193mg/kg组其精子数量分别为443.6±98.2、428.5±80.3和420.9±78.9×106/g,精子活动率均降低,分别为：82.9%、75.6%和64.84%,且染毒水平越高,大鼠附睾内精子数目和精子运动率降低越明显(P<0.05,P<0.01)。采用伊红染色显微镜下观察大鼠睾丸精子形态,未见及精子头尾相连、卷尾、小头、无定型头、无头、无尾等几类畸形精子。8. TCCA对SD血液系统的影响在0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1剂量水平下连续染毒24个月,分别于实验第6、12、18、24个月时,定期采集大鼠血液进行血液系统常规和血生化检测。结果发现虽然在某些检测时间点某数个检测项目与对照组相比增加或降低,差异有统计意义(P<0.05、P<0.01、P<0.001),但这种差异在各剂量组间的分布无明显规律性,未发现有明显的剂量-效应反应关系。表明在0.71、2.29、7.59mg·kg-1·d-1剂量水平下连续24个月染毒,TCCA对雄性SD大鼠血液系统无明显的毒性作用。在96.5、193mg/kg剂量水平下连续10天染毒TCCA,4周龄幼年大鼠各个剂量组与12周龄大鼠96.5mg/kg剂量组大鼠血中AKP、ALT、AST、LDH的酶活性及血清离子Ca2+、Cl-、K+、Na+的浓度均无明显差异；12周龄大鼠193mg/kg剂量组血清LDH活性升高,血中Ca2+、Cl-降低(P<0.05),其他指标与对照组比较,差异均无显著性。以上结果提示：TCCA对血液系统的影响与染毒水平有关,在在193mg/kg剂量水平下,TCCA能引起血液内LDH活性升高,Ca2+、Cl-浓度降低。结论：1、TCCA对大鼠的长、短期染毒均能导致睾丸组织学形态发生改变,并以睾丸重量减轻、睾丸曲细精管萎缩为主要改变,TCCA对雄性SD大鼠睾丸具有明显的生殖毒性。2、TCCA对睾丸损伤程度与TCCA接触水平、接触时间呈量效关系,即睾丸的损伤程度随TCCA染毒水平的增加而加重,随接触时间的延长而加重。3、TCCA可引起大鼠精子数量减少、精子运动率降低,但未发现其能导致精子畸形的发生。4、TCCA促进睾丸生精细胞凋亡的发生是其毒性作用方式之一。睾丸细胞凋亡的增加与TCCA下调睾丸内Bcl-2/Bax蛋白表达、上调FasL和Caspase-3蛋白表达及Fas mRNA、Bcl-2mRNA表达水平有关。5、TCCA可通过降低睾丸内锌、铜的含量,发挥其对睾丸的生殖毒性作用。6、TCCA对大鼠行为活动、体重、血液系统的影响与染毒剂量水平有关。TCCA对雄性SD大鼠24月饲喂给药的最大无作用剂量为0.71mg·kg-1·d-1。若以100倍安全系数计,则其ADI为0.0071mg·kg-1·d-1。