箬叶抗菌成分的分离、鉴定与抗菌机理研究

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实验室前期研究确定箬叶提取物对烟草链格孢菌具有抗菌活性,但抗菌机理尚不明确。本文以箬叶为实验材料,烟草链格孢菌为供试菌株,对箬叶抗菌成分进行分离、纯化和鉴定,并对箬叶抗菌成分的抗菌机理进行了初步探索。采取闪式提取技术获得箬叶粗提物,其提取工艺条件为:取粒径小于0.425 mm的箬叶粉末,按料液比3∶5∶3∶12(g∶m L∶m L∶m L)的比例依次加入无水乙醇、冰乙酸与纯水,混匀,进行闪式提取(闪式提取条件:浸泡40 min,电压120 V,时间40 s),减压抽滤,提取两次;合并提取液,浓缩蒸干,取无水乙醇溶解部分浓缩蒸干作为箬叶粗提物。采用菌丝生长速率法和孢子萌发法对箬叶粗提物进行抗真菌活性测定。毒力实验表明箬叶粗提物对烟草链格孢菌菌丝生长的EC50为3.67mg/m L,对孢子萌发的EC50值为3.74 mg/m L。使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇三种有机试剂对箬叶粗提物进行萃取分离,通过菌丝生长速率法评价各萃取相的抗菌活性。结果表明,各萃取相中,对烟草链格孢菌菌丝生长抑制活性最高的是乙酸乙酯相,在3.67 mg/m L时,其菌丝生长抑制率为54.39%。毒力实验表明箬叶乙酸乙酯相萃取物对烟草链格孢菌菌丝生长抑制作用的EC50值为3.08 mg/m L,对孢子萌发抑制作用的EC50值为1.74 mg/m L。采用硅胶柱层析,通过不同极性的洗脱剂洗脱,对箬叶粗提物的乙酸乙酯相萃取物进行分离纯化。最终获得了抗菌活性较高的组分Fr.1.2及Fr.1.3,经LC-MS分析,初步推断出Fr.1.2的成分可能是异当药黄素、牡荆素以及5,2’,4’-三羟基-6,7,5’-三甲氧基黄酮,Fr.1.3的主要含有可能是苜蓿素-7-O-β-D-葡萄糖苷、苜蓿素、香叶木素或7-羟基-5,3,4’-三甲氧基黄酮,均为黄酮类物质。采用箬叶乙酸乙酯相萃取物探索箬叶抗菌成分的抗菌机理。结果表明:箬叶抗菌成分能够破坏菌丝的膜结构,使菌丝的通透性改变,在用药浓度4 mg/m L的条件下,正常菌丝体内的电解质和核酸逐渐外泄,30 h后基本达到内外平衡。在烟草链格孢菌菌丝生长发育过程中,箬叶抗菌成分能够抑制菌丝体葡聚糖、麦角固醇和可溶性蛋白的合成,与对照相比,葡聚糖各官能团特征吸收峰振幅明显下降,麦角固醇含量下降了22.34%,可溶性蛋白合成受抑制率为12.70%。箬叶抗菌成分能促进烟草链格孢菌产孢,但孢子的萌发率会降低;扫描电镜显示实验组中孢子表面鼓起,孢子更易受到伤害。箬叶抗菌成分作用靶点可能是细胞膜以及某些代谢途径。
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