论文部分内容阅读
组织因子途径抑制物（TFPI）是体内外源性凝血途径的天然抑制物。该蛋白由276个氨基酸组成,含有一个酸性的N末端,三个串联的Kunitz型结构域KD1、KD2、KD3和一个碱性的C末端。KD1和KD2与TFPI的抗凝作用紧密相关:KD2通过与FXa结合形成FXa/TFPI复合物,抑制FXa的活性;KD1随后与组织因子（TF）/FVIIa复合物中FVIIa结合,形成FXa/TFPI/FVIIa/TF四元复合物,抑制FVIIa/TF的整体活性。KD3和C术端能够使TFPI达到最佳抗凝效果,但具体机制尚不明确。TFPI与肝素、低密度脂蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）、血小板反应素-1（TSP-1）和脂多糖（LPS）等分子的结合都与KD3和C末端,后两者还被认为与TFPI抑制血管平滑肌增殖、诱导血管内皮细胞和系膜细胞凋亡有关。尽管重组TFPI尚未上市,但其在临床中的应用价值一直是人们关注的热点。在动脉粥样硬化动物模型中,重组TFPI能显著降低血小板及纤维蛋白在斑块破裂部位的沉积;TFPI基因局部转染到经球囊损伤的动脉粥样硬化血管,可以显著抑制内膜的增生;在感染性脓毒血症或血管弥漫性内凝血（DIC）中,重组TFPI可以降低血浆中IL-6和TNF-a等炎症因子的水平,动物的存活率或存活时间均显著提高;重组TFPI治疗败血症已经完成Ⅲ期临床试验,显示能够降低患者28天内的死亡率;TFPI防治深静脉血栓、呼吸窘迫综合征、缺血再灌注损伤、恶性肿瘤转移中亦显示出较好疗效。长期以来,TFPI的研制一直受限于蛋白表达水平低下。最初的实验用TFPI来源于血浆提取和HepG2细胞培养上清,之后虽然分别在真核和原核系统获得表达,但又各自存在缺陷。真核表达获得的TFPI活性好,但表达量很低、代价高,所以不利于TFPI大量制备。原核细胞虽然能够提高表达水平,但目的蛋白以包涵体形式存在,变复性后的纯化过程相当繁琐,也不适合于临床研究。本研究首先希望找到一种既能保证TFPI活性又能实现高效表达的方式。首先,我们借助于原核表达系统的融合标签麦芽糖结合蛋白（MBP）,以期实现在原核中获得有活性的TFPI可溶性表达。虽然我们获得了TFPI的可溶性表达,遗憾的是表达的TFPI没有活性。进而,我们采用毕赤酵母表达系统,分别从基因二级结构、密码子偏好方面对基因进行了优化,最后获得了一定水平的具有活性的TFPI表达。本课题组的前期研究发现TFPI能够诱导大鼠肾系膜细胞发生凋亡,且诱导凋亡的部位主要位于TFPI 161位氨基酸以后。为了明确TFPI诱导凋亡的具体结构和抗凝功能,我们分别表达了TFPI161以后的区域:TFPI162-188为KD2和KD3之间的一段连接区,TFPI187-241为KD3,TFPI240-276为C末端,TFPI162-241包括KD2和KD3之间的连接区及KD3,TFPI187-276包括KD3和C末端,TFPI162-276则包括所有上述结构。将上述肽段分别融合于MBP的C末端,在大肠杆菌中获得了表达;目的蛋白以可溶形式存在,经亲和层析和离子交换层析纯化获得。通过活性分析,发现TFPI C末端具有抗凝活性,并且KD3能够增强C末端的抗凝作用,但KD3本身不具有抗凝作用。经凋亡实验发现,TFPI162-276能够诱导系膜细胞发生凋亡,C末端在其中发挥主要作用。类似于抗凝功能,KD3不能够单独诱导系膜细胞凋亡,但能够增强C末端诱导的凋亡。由于TFPI C末端能够诱导系膜细胞凋亡,而系膜细胞是肾小球肾炎中关键细胞。该细胞的增生活化以及其分泌的细胞因子、细胞外基质在增生性肾小球肾炎发展中起了关键作用。抑制系膜细胞增殖或者诱导其凋亡,是治疗增生性肾小球肾炎的关键手段。为了评价TFPI及其片段在体内是否具有相同的促进肾小球系膜细胞凋亡作用,我们在大鼠抗Thy-1肾炎模型中,从动物整体观察了TFPI、TFPI162-276以及单独的C末端对系膜细胞的影响,以及对增生性肾小球肾炎的治疗作用。实验发现,TFPI的C末端在体内抑制了系膜细胞的增殖与活化,同时对肾功能起到了保护作用:TFPI162-276组保护肾功能、减少肾小球内细胞数表现出一定治疗意义,但效果不及C末端组;TFPI处理组则未发现有类似作用。造成体内和体外以及各分子段之间的这种差异可能与实验中选用的转基因系统的时效性以及表达效率的不一致性有关。我们认为,TFPI的C末端在体内外均显示对系膜细胞具有减少增殖、促进凋亡的作用,且能保护增生性肾小球肾炎时的肾功能,有望成为系膜细胞增生型肾小球肾炎治疗的新型多肽。