论文部分内容阅读
养蚕业在我国是农业组成的一部分并且已经有5000多年的历史,在人类经济生活和饲养史中占有重要位置。家蚕(Bombyx mori L.)是一种重要的经济昆虫,其重要性不仅是能够生产蚕丝还由于蚕蛹自身拥有丰富的营养成分而具有重要价值。目前,我国有超过10个省的上千万人参与养蚕业或相关的行业中。氟元素广泛的存在于自然界中,当家蚕摄入氟元素过量时会导致死亡。近年来,由于多种生态因素会使桑叶受到污染,如含氟废弃物、工业生产后的含氟排放物和水源受氟污染等,进而导致区域性家蚕氟中毒事件时有发生,严重的影响了养蚕业的经济生产。氟离子是原生质毒剂,属于胃毒,其最初在家蚕中肠内累积而后进入血液及其它组织器官,因此其能够严重的破坏中肠组织。中肠不但具有消化吸收营养物质的功能还具有防御有毒有害物质和病原微生物入侵等作用。家蚕肠道内广泛多样的微生物组成了肠道微生态系统,其是中肠的天然保护屏障并且对促进氟离子排泄具有重要作用。氟胁迫后家蚕中肠的理化指标和肠道微环境会发生改变进而影响肠道微生物菌群的组成,因此研究家蚕肠道微生态环境的变化与自身耐氟性的相互关系具有重要的意义。本文主要研究结果如下:1.氟胁迫对不同抗性家蚕相关理化指标的影响通过对不同抗性家蚕品种T6和734的氟胁迫处理,检测其中肠和血液中总超氧化物歧化酶(SOD)酶活力、总胆固醇(TC)和甘油三脂(TG)含量、肠道内容物水分和p H值、以及短链脂肪酸(SCFAs)含量的变化。氟胁迫后在T6试验组血浆中总SOD酶活力分别为对照组的0.53倍、2.49倍和2.66倍;734试验组血浆中总SOD酶活力分别为对照组的0.79倍、1.70倍和2.01倍。在T6试验组中肠组织中总SOD酶活力分别为对照组的0.93倍、1.23倍和1.36倍;734试验组中肠组织中总SOD酶活力分别为对照组的1.43倍、0.83倍和0.54倍。T6试验组血清中胆固醇含量分别为对照组的0.88倍、0.56倍和0.33倍,家蚕734试验组中胆固醇含量分别为对照组的0.64倍、0.45倍和0.18倍。T6试验组血清中甘油三脂含量分别是对照组的0.57倍、0.63倍和0.74倍,而家蚕734试验组血清中甘油三脂含量分别是对照组的0.82倍、0.73倍和0.60倍。氟胁迫对家蚕T6和734肠道内容物中的水分含量无显著性影响;而对家蚕734肠道内p H值有显著影响(P<0.05),其肠道内p H值由9.76±0.07下降到8.57±0.14。氟胁迫对家蚕肠道内容物中几种短链脂肪酸含量的影响均达到显著性差异(P<0.05),并且对主要短链脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸的影响最为明显。以上结果表明氟胁迫对家蚕多项理化指标均有影响且对中肠的影响作用更大。2.氟胁迫对不同抗性家蚕中肠蛋白质表达的影响蛋白质是生命活动的主要行使功能者,本研究利用双向电泳技术(two dimensional electrophoresis,2-DE)配合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测氟胁迫后家蚕中肠蛋白质表达的差异。试验通过筛选去除重复蛋白点及不可信蛋白点后共得到23个差异蛋白点,利用KEGG分析找出他们所参与的代谢通路。通过分析表明这些蛋白点主要参与糖代谢,再利用q RT-PCR技术检测其中V-ATPase subunit A、V-ATPase subunit B、Enolase、Aldose Reductase等蛋白点基因的表达量。研究发现这4个蛋白点基因的表达量在氟胁迫后不同抗性家蚕体中肠内均会受到抑制作用,这说明氟胁迫会影响家蚕正常的生理活动可能是家蚕致死的关键因素之一。3.氟胁迫对不同抗性家蚕肠道内产消化酶菌群组成结构的影响肠道微生物能够产生多种酶类,其中有大量的胞外消化酶如酪蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶等,这些酶能够促进家蚕对桑叶中营养成分的消化吸收。本研究利用微生物传统培养法结合筛选培养基鉴定氟胁迫后不同抗性家蚕肠道内产消化酶菌群结构和产酶类型,有助于了解氟胁迫对不同抗性家蚕肠道菌群营养型的影响。试验结果显示:家蚕肠道内产消化酶细菌主要属于厚壁菌门Firmicutes和变形菌门Proteobacteria,氟化物能够降低家蚕肠道内可培养细菌的数量并且对734达到显著性影响(P<0.05)。氟胁迫后家蚕T6肠道内的产酶菌组成和消化酶种类没有明显变化;而家蚕734肠道内的产酶菌组成和消化酶种类变的单一,主要为产脂肪酶的葡萄球菌属Staphylococcus细菌。这说明氟胁迫能够改变家蚕734肠道内的微环境从而不利于肠道内某些产消化酶细菌的定植,并且通过对产消化酶细菌组成的改变来影响家蚕对营养物质的吸收类型。4.氟胁迫对不同抗性家蚕肠道内优势菌群的影响家蚕肠道内定居着大量微生物,这些微生物组成了肠道微生态系统。本研究利用PCR扩增家蚕肠道细菌16S r RNA基因构建克隆文库并用核糖体DNA限制性分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)方法对克隆子分型。从家蚕T6和734肠道样品中共获得14种分类操作单元(operational taxonomic unit,OTUs),以16S r RNA基因为基础构建发育树进行分析。再经巢式PCR(nest PCR)和变形梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术检测家蚕肠道内优势菌群的变化。结果显示:不同抗性家蚕肠道微生物的香农维尔指数(Shannon-Wiener index)变化趋势不同,家蚕734肠道微生物受氟化物的影响更大。氟胁迫后家蚕肠道内的肠球菌属Enterococcus和芽孢杆菌属Bacillus细菌菌群减少,而葡萄球菌属Staphylococcus的细菌增多。这说明氟胁迫能够通过改变家蚕肠道内细菌的优势菌群和菌群比例从而破坏家蚕肠道微生物区系的平衡。5.氟胁迫对不同抗性家蚕肠道微生物多样性的影响高通量测序是近几年研究宏基因组的流行技术手段。本研究利用Illumina Miseq测序平台研究氟胁迫对不同抗性家蚕肠道微生物的OTU数量、组成、相似性、以及α和β-多样性的影响。家蚕734-T组的OUT数和Shannon-Wiener index与家蚕T6达到显著差异(P<0.05),而Chao 1指数与其余几组均达到显著差异(P<0.05)。肠道微生物菌群组成上T6-T与T6-C基本相同,而734-T与734-C的组成则明显不同。734-T组的奇古菌门Thaumarchaeota、绿弯菌门Chloroflexi、广古菌门Euryachaeota和未分类菌unclasified明显增多,而Firmicutes门细菌则明显减少,其主要减少的为Enterococcus、Lactococcus和Bacillus几属细菌。通过对肠道菌群的聚类分析表明T6-C与T6-T组的肠道菌群关系最近然后是734-C,距离最远的是734-T的肠道菌。在PCo A主坐标分析中,在T6-C、T6-T和734-C组的9个样品空间距离较近,而与734-T组的3个样品距离较远这与聚类分析结果相似。氟胁迫能够明显改变家蚕734肠道内的宏基因组,并且肠道微生物菌群的动态变化和古菌的出现与其自身对氟化物的耐受性相关。6.耐氟枯草芽孢杆菌SWL-19的筛选鉴定及益生效果研究益生菌是指一类对宿主健康其促进作用并具有多种生物活性的活体微生物。本研究利用高温选育法对家蚕肠道内的芽孢杆菌进行初筛,以产多种胞外消化酶和能富集氟离子的特性为基础,结合溶血试验、抗生素药敏试验和产消化酶能力大小等对芽孢杆菌进行复筛。通过形态、生理生化特征和16S r RNA序列分析鉴定菌种,再利用添食饲喂法研究其对氟胁迫家蚕的益生效果。通过初筛和复筛得到一株Bacillus sbutilis SWL-19,其细胞大小为0.7~0.9×2.8~3.2μm、能产多种胞外消化酶、对大多数抗生素敏感、无溶血性、具有革兰氏染色阳性和产芽孢等生理生化特征,与Bacillus subtilis strain YQH 60(HQ143659.1)有100%的同源性。SWL-19能耐受1600 mg/kg氟离子浓度,并且在含100 mg/kg氟化物的培养基中其富集系数为78.4。通过对氟胁迫家蚕734添食该菌后可显著性(P<0.05)提高蚕体重和降低死亡率。以上试验表明:枯草芽孢杆菌SWL-19能明显减轻氟胁迫对家蚕的影响,证实利用微生物提高家蚕对氟化物的抗性是可行的,为蚕业生产中氟中毒事件提供一种可行应对策略和解决方法。