ZnO/nHA仿骨结构活性增强羟基磷灰石骨修复材料的构建及体外生物活性研究

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目的:根据医疗器械生物学评价标准(ISO 10993-5),本文将对不同质量浓度比Zn的ZnO/nHA材料及其与RBMSCs的复合材料进行体外生物学性能评价,并筛选出含Zn量最佳的ZnO/nHA复合材料。方法:本研究将ZnO/nHA复合材料分为6组:空白对照、0%、1%、3%、5%和7%Zn含量的ZnO/nHA复合材料。本文实验主要分为以下几部分:(1)针对材料本身的溶血率:制备6组材料的浸提液,通过读取分光光度计OD值计算材料对兔血的溶血率;(2)材料抗菌效果的检测:选用6个材料组分别定性和定量测定不同材料组对金黄色葡萄球菌的抗菌效果,并计算抗菌率;(3)培养兔的原代骨髓间充质干细胞:以幼兔为实验对象,取其骨髓进行原代细胞培养,并经流式细胞仪鉴定纯度;(4)将RBMSCs与不同含Zn量的ZnO/nHA复合材料共培养,测RBMSCs在材料上的贴壁率:选用0%、1%、3%、5%和7%ZnO/nHA材料组直接黏附兔的骨髓间充质干细胞(rabbit bone marrow derived mesenchymal stem cells,RBMSCs),24h后计算RBMSCs的贴壁率,并利用扫描电子显微镜(SEM)观察24h后5种材料对RBMSCs黏附的影响;(5)ZnO/nHA复合材料对RBMSCs增殖的影响:为避免材料表面性能对RBMSCs黏附数量的影响,制备6组材料的浸提液,利用CCK-8法分析不同材料不同时间点对RBMSCs增殖的影响。结果:(1)6组材料的溶血率均低于5%,各组材料均未出现溶血现象,可作为下一阶段试验的可靠基础。(2)定性抗菌实验中,与对照组和0%ZnO/nHA相比,掺锌的羟基磷灰石材料有明显的抗菌效果,1%、3%、5%和7%Zn含量的ZnO/nHA复合材料平板内抑菌圈直径分别为1.3cm、1.5cm、1.6cm、1.7cm,说明随着锌含量的增加抑菌效果越显著;定量抗菌实验进一步证实了这一观点,且锌含量在3%及以上的含量,抗菌率均在90%以上。(3)以CD90作为的阳性标志,CD45为其阴性标志,经流式细胞术检测证实所培养的细胞确为骨髓间充质干细胞,该细胞具有贴壁生长特性。(4)经SEM观察,RBMSCs能够在材料表面黏附并健康生长;计算贴壁率后得出与0%ZnO/nHA组相比,1%ZnO/nHA组有显著差异,且贴壁率达80%,贴壁效果最佳。(5)对培养1d、2d、3d、4d和5d的RBMSCs进行增殖测定,发现与对照组相比,0%、1%、3%Zn含量的ZnO/nHA材料的增殖曲线大致相同,且1%组与3%组比较,1%组的增殖效果更好;而5%、7%Zn含量的ZnO/nHA材料的增殖曲线平缓,甚至有下降的趋势。结论:综合RBMSCs的溶血、抗菌、黏附、增殖几方面的实验结果,发现在本实验研究中1%ZnO/nHA复合材料具有更好的细胞活性。
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