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目的:在脑胶质瘤中,血肿瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)的存在是限制大分子抗肿瘤药物进入肿瘤组织,从而影响化疗疗效的关键因素。与血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的组成不同,胶质瘤细胞的生长破坏了正常的BBB结构,组成了BTB。BTB的通透性虽略高于BBB,但仍然能够阻止大分子抗肿瘤药物通过。因此,选择性增加BTB的通透性,有效地将药物转运到脑胶质瘤组织,切实提高脑胶质瘤的治疗效果,是脑胶质瘤综合治疗一个亟待解决的问题。内皮-单核细胞激活多肽-Ⅱ(endothelial monocyte-activating polypeptide-II,EMAP-Ⅱ)由其前体物质proEMAP-Ⅱ分解而成,能够调节内皮和单核细胞的功能。目前研究发现,EMAP-Ⅱ具有多种调控细胞功能的作用。有研究报道小剂量EMAP-Ⅱ(0.05nM)具有选择性开放BTB的作用。EMAP-Ⅱ通过cAMP/PKA通路以及PKC-ζ/PP2A通路选择性增加BTB的通透性。在体外BTB模型中,小剂量EMAP-Ⅱ能够与肿瘤微血管内皮细胞膜上的α-ATP合酶结合,通过下调紧密连接相关蛋白(ZO-1、occludin和claudin-5)的表达,开放紧密连接,选择性地增加BTB的通透性。另有研究显示在调节紧密连接的信号分子中,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是调节紧密连接动态变化,影响内皮细胞间通透性的重要分子。PKC激活能通过磷酸化紧密连接相关蛋白并诱导其重分布,发挥直接调节紧密连接的作用。研究发现EMAP-Ⅱ能够通过激活PKC增加BTB模型的通透性,预先给予PKC抑制剂H7能够阻断EMAP-Ⅱ增加BTB通透性的作用,提示PKC的表达及活性变化在EMAP-Ⅱ调节BTB通透性中起重要的调节作用。MicroRNAs是一类长度为18-25个核苷酸的非编码小分子RNA,多在转录后水平上调节靶基因的表达,进而在生理和病理过程中调控多种细胞的生物学功能。MircoRNA-330(miR-330)基因是Weber在2005年发现的,定位于19q13.32,在多种组织中表达,但功能不同。miR-330-3p作为miR-330的重要亚型之一,在不同组织中发挥不同作用。目前miR-330-3p对脑胶质瘤微血管内皮细胞的作用尚未见报道。通过应用生物信息学软件预测到,在PKC-α的mRNA第2038-2044和3115-3121位点3’UTR存在miR-330-3p结合位点,因此推测EMAP-Ⅱ可能是通过miR-330-3p实现对PKC-α的调节,进而影响BTB的通透性。本实验首先研究miR-330-3p在脑胶质瘤微血管内皮细胞中的内源性表达,研究EMAP-Ⅱ作用下miR-330-3p的表达是否发生变化,进一步研究EMAP-Ⅱ是否通过调控miR-330-3p的表达影响BTB的通透性,以及miR-330-3p调控BTB通透性的效果及机制。本研究旨在揭示小剂量EMAP-Ⅱ选择性增加BTB通透性的机制,以及为胶质瘤的综合治疗提供新思路。研究方法:1、分别培养人脑星形胶质母细胞瘤细胞系U87细胞、人胚肾细胞系HEK293T和人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3。2、通过hCMEC/D3与U87细胞共培养,建立体外BTB模型,hCMEC/D3成为脑胶质瘤微血管内皮细胞(glioma microvascular endothelial cells,GECs)。3、细胞转染和稳定表达细胞的建立:miR-330-3p过表达、miR-330-3p表达沉默的稳定表达hCMEC/D3细胞和U87细胞。4、应用real-time PCR检测GECs中miR-330-3p的表达水平。5、应用跨内皮电阻(transendothelial electric resistance,TEER)评估体外BTB模型的完整性。6、应用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)流量测定评估体外BTB模型的通透性。7、应用real-time PCR、Western blot检测GECs中紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表达变化。8、应用real-time PCR、Western blot和免疫荧光法检测GECs中PKC-α的蛋白表达变化和在细胞中分布变化。9、应用双荧光素酶报告基因实验分析miR-330-3p对PKC-α3’UTR区的靶向调节。10、应用免疫荧光法检测GECs中紧密连接蛋白的分布与表达。11、应用流式细胞检测EMAP-Ⅱ、阿霉素(Dox)、EMAP-Ⅱ+anti-i R-330-3p+PKC-αactivator、以及EMAP-Ⅱ+anti-miR-330-3p+PKC-αactivator+Dox组对U87胶质瘤细胞的增殖和凋亡的影响。结果:1、在GECs中,miR-330-3p高表达。2、小剂量(0.05nM)EMAP-Ⅱ降低GECs中miR-330-3p表达。在不同时间点,miR-330-3p表达量不同,在1h时最低。3、过表达miR-330-3p显著降低BTB的通透性,miR-330-3p表达沉默显著增加BTB的通透性。EMAP-II作用于BTB,能显著降低BTB的通透性。与EMAP-Ⅱ组相比,miR-330-3p表达沉默+EMAP组显著降低BTB通透性。4、过表达miR-330-3p增加GECs中紧密连接相关蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表达。miR-330-3p表达沉默减低GECs中紧密连接相关蛋白的表达。EMAP-Ⅱ作用后,GECs中紧密连接相关蛋白的表达水平明显降低;与EMAP-Ⅱ组相比,miR-330-3p表达沉默+EMAP-Ⅱ组显著降低紧密连接相关蛋白在GECs中的表达。5、过表达miR-330-3p下调GECs中PKC-α的mRNA和蛋白表达以及磷酸化水平。EMAP-Ⅱ作用后,GECs中PKC-α的mRNA和蛋白表达水平明显升高。与EMAP-Ⅱ组相比,miR-330-3p表达沉默+EMAP-Ⅱ组GECs中PKC-α的mRNA和蛋白表达以及磷酸化水平明显升高。6、激光共聚焦显微镜显示miR-330-3p过表达组PKC-α呈现低染,EMAP-Ⅱ作用后,GECs中PKC-α的表达明显增加,miR-330-3p表达沉默+EMAP-Ⅱ组与EMAP-Ⅱ组相比,PKC-α的表达明显增加。7、MiR-330-3p通过靶向结合PKC-α的3′-UTR区抑制PKC-α的表达。8、PKC-α激活剂显著增加BTB通透性,显著降低紧密连接相关蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表达,过表达miR-330-3p能够逆转PKC-α调节BTB通透性以及紧密连接相关蛋白表达。9、与EMAP-Ⅱ、Dox、EMAP-Ⅱ+anti-iR-330-3p+PKC-αactivator组相比较,EMAP-Ⅱ+anti-miR-330-3p+PKC-αactivator+Dox组显著抑制胶质瘤细胞的增殖并促进了细胞凋亡。结论:1、miR-330-3p在脑胶质瘤微血管内皮细胞中高表达。miR-330-3p上调胶质瘤微血管内皮细胞中紧密连接相关蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表达,降低BTB的通透性。2、mi R-330-3p通过靶向结合PKC-α的3′-UTR区,调控PKC-α的表达;以及调节PKC-α的活性影响BTB的通透性。3、小剂量EMAP-Ⅱ通过下调miR-330-3p,增加PKC-α表达和活性,降低胶质瘤微血管内皮细胞中紧密连接相关蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表达,增加BTB的通透性。4、EMAP-Ⅱ、anti-miR-330-3p、PKC-αactivator三者联合应用能够促进阿霉素的抑制胶质瘤细胞增殖的效应。