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组织蛋白酶D (Cathepsin D, CD)是一种重要的蛋白水解酶,它不仅在溶酶体内降解蛋白质,还能分泌至细胞外发挥作用。在多种肿瘤、乃至肿瘤患者的血液中都发现了高丰度的CD。一般认为,CD通过剪切细胞外基质蛋白而促进肿瘤细胞的侵袭和转移,但CD的剪切特征性及底物选择性仍不十分清楚。本研究试图以天然蛋白质为底物、利用蛋白质组学技术鉴定CD的剪切位点,进而系统地分析CD识别位点和底物选择特征性。我们构建了A549 CD-knockdown的稳定细胞株,收集了A549和A549 CD-knockdown细胞的分泌蛋白质。通过双向电泳、Western blot和质谱分析,我们验证了在A549CD-knockdown细胞中CD丰度呈显著下降,而且在分泌蛋白中也没有发现可检测的CD。通过细胞迁移实验,我们观察到CD-knockdown抑制了A549细胞的迁移能力,再次证实了CD影响了肿瘤细胞的侵袭和转移,从而明确了鉴定CD酶切特征的必要性。我们以牛血清白蛋白(BSA)为典型的CD底物蛋白,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测CD在该蛋白质上的剪切位点。CD在BSA上的剪切位点中,P1位置(肽段碳端的第一位氨基酸)上的疏水氨基酸出现频率较高,同时P1’位置(肽段氮端的第一位氨基酸)上氨基酸的疏水性也影响了CD对位点的识别。我们首次提出了比邻氨基酸的疏水值(the Hydrophobic Scores of Neighbors, HSN)用以描述CD剪切位点的疏水微环境；HSN数值越高,相应位点被CD剪切的可能性越大。我们以卵清白蛋白(OVA)为典型的CD非剪切蛋白,天然状态OVA不能被CD剪切；但变性OVA则容易被CD剪切。重要的是,CD在变性OVA上的剪切特点与在BSA上的剪切特征基本一致：HSN数值越高的位点被CD剪切的可能性越大,这表明一旦CD能够进入到OVA分子内部,HSN则成为OVA能否被CD水解的重要判据之一我们选取了常用的CD底物、三种同源家族蛋白质、自水解蛋白质作为研究对象来分析HSN是否具有普适性。结果表明,CD在这些蛋白质上的识别特征十分相似,都是亮氨酸和苯丙氨酸在P1出现频率最高；同时,HSN也是CD剪切与否的一个敏感判据,HSN0.5～1.0是判断位点能否被CD剪切的阈值范围。利用双向电泳和质谱技术,我们在A549 CD-knockdown细胞中发现核苷二磷酸激酶A(NDKA)、硫氧还蛋白(Trx)、脂肪酸结合蛋白(FABP5)和肌动蛋白辅助蛋白(COTL1)均不易被CD剪切。我们对CD易/不易剪切蛋白质的二级结构和空间结构进行了分析,发现属于all α-helix结构的蛋白质一定是CD易剪切底物,而all β-sheet结构的蛋白质则基本不易被CD剪切。我们推断,CD酶解的先决条件是蛋白质空间结构能够允许CD接近剪切位点；满足该条件后,则HSN的大小决定CD识别位点。