背景与目的： 非霍奇金淋巴瘤(Non—Hodgkins lymphoma，NHL)是原发于淋巴结和其他器官淋巴组织的恶性肿瘤，分为B细胞、T细胞和NK细胞等类型。T细胞淋巴瘤(T cell Non—Hodgkins lymphoma，T—NHL)在亚洲人种中的发病相对多见，约占30％左右，相比较于B细胞淋巴瘤，T细胞来源的淋巴瘤侵袭性更强，临床过程更凶险，预后更差。T—NHL目前尚无标准的治疗策略，对T—NHL分子机理进一步研究，探索新的治疗途径，是提高T—NHL的治疗效果的关键。 近年来研究表明一些饱和和不饱和脂肪酸具有抗肿瘤的作用。侧链饱和脂肪酸13-甲基十四烷酸(13-methyltetradecanoic acid，以下简称13-MTD)，是从大豆发酵产物中提取的饱和脂肪酸，是一种天然物质，既往研究发现：小剂量13-MTD能特异性诱导包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌细胞、白血病等多种不同肿瘤细胞的凋亡，而对正常细胞没有明显影响。口服13-MTD能明显抑制小鼠原位种植前列腺癌的生长(高效)，而小鼠急性毒性实验结果显示13-MTD急性毒性较低(低毒)。由于13-MTD口服后由肠道吸收，并以乳糜颗粒形式转运到淋巴液中，可以在机体的淋巴系统中形成较高的药物浓度。因此，本研究希望能够把这种广谱高效的药物引入NHL的治疗，尤其是对常规化疗疗效欠佳的T—NHL治疗中。 既往研究证明13-MTD的抗肿瘤作用是通过诱导凋亡产生的。细胞凋亡异常与肿瘤发生、发展密切相关，肿瘤凋亡由两个主要信号途径调节：死亡受体途径和应激介导途径。前者依赖于死亡受体，如Fas受体、肿瘤坏死因子受体、TRAIL受体1、2等的激活；后者由不同的应激信号诱导，并引起线粒体通透性改变，释放细胞色素c(cytochrome c，cyto c)及激活下游的Caspase而诱导细胞凋亡。 最近研究表明：人弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)细胞株中PI3K/AKT存在持续活化，抑制PI3K/AKT通过从线粒体释放cyto c及激活下游的Caspase可以诱导大多数DLBCL凋亡，并且，p—AKT过度表达的患者预后较差，提示PI3K/AKT在NHL的发病过程中起着重要作用。PI3K—Akt信号通路在人类肿瘤谱中广泛失调，PI3K与AKT是促进抗细胞凋亡作用的重要调节因子，其过度表达可抑制细胞的凋亡。 有关饱和脂肪酸13-MTD对T—NHL的抗瘤作用研究在国内外属于空白，其诱导凋亡机理研究也尚未有报道。本研究的目的是：①研究13-MTD对T—NHL的体内、体外抗肿瘤作用；②研究13-MTD是否通过诱导T—NHL细胞凋亡产生抗肿瘤作用；③诱导T—NHL细胞凋亡的信号途径，及13-MTD是否通过下调PI3K/AKT及其下游通路诱导肿瘤细胞凋亡，阐明13-MTD抗T—NHL的机理。 方法与结果： 一、13-MTD对Jurkat、Hut—78及EL4 T—NHL细胞株的体外抗增殖活性 取对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板，设13-MTD不同的浓度(80、60、40、20、10μg/mL)、相应的溶剂对照及空白对照组。采用CCK—8法测定每孔OD值，Bliss法计算半数抑制浓度(IC50值)。结果：13-MTD对以上3种T—NHL细胞增殖均有抑制作用。48hIC50值分别为：Jurkat细胞：25.74±3.50μg/mL；Hut78细胞：31.29±2.27μg/mL；EL4细胞：31.53±5.18μg/mL。 进一步检测了不同作用时间下13-MTD对Jurkat细胞的生长抑制作用的影响，发现13-MTD对Jurkat细胞的抑制作用随时间的延长而加大；其24h、48h和72h的IC50值分别为38.51±0.72μg/mL；25.74±3.50μg/mL和11.82±0.90μg/mL。 二、13-MTD诱导T—NHL细胞凋亡及机理研究 1、流式细胞仪检测细胞周期分布 不同浓度的13-MTD处理Jurkat细胞后，采用流式细胞仪检测DNA的含量，LYSIS软件分析。结果：不同剂量13-MTD作用Jurkat细胞48h后，细胞出现不同程度的G1期阻滞，呈剂量依赖性。 2、流式细胞仪检测细胞凋亡 Jurkat细胞经不同剂量13-MTD处理12h、24h、48h后，均出现不同比例的凋亡细胞，呈剂量依赖性和时间依赖性。Hut78及EL4细胞经不同剂量13-MTD分别处理48h后，也均出现不同比例的凋亡细胞，呈剂量依赖性。 3、13-MTD处理后对Jurkat细胞中Caspase—3蛋白及Caspase酶解产物PARP表达的影响 60μg/mL13-MTD及相应溶剂分别作用Jurkat细胞2h、6h、12h和24h后，药物处理组Caspase—3及PARP的活性断裂片段早在药物作用2小时就出现，而且随作用时间延长而增多。 4、13-MTD对Jurkat细胞死亡受体途径中蛋白的影响 Western blot分析显示60μg/mL13-MTD及相应溶剂作用2h、6h、12h和24h后，药物处理后的Jurkat细胞中磷酸化的FADD蛋白水平没有明显的改变(P>0.05)。 5、13-MTD对Jurkat细胞胞浆蛋白中cyto c蛋白的影响 60μg/mL13-MTD及相应溶剂作用2h、6h、12h和24h后，Jurkat细胞胞浆有cyto c表达，随作用时间增加而明显增加，60μg/mL13-MTD作用6h后即可看到cyto c从线粒体释放入胞浆中。 6、13-MTD对Jurkat细胞中Bcl—2蛋白表达的影响 Western blot结果表明：60μg/mL13-MTD及相应溶剂分别作用Jurkat细胞2h、6h、12h和24h后，Jurkat细胞中Bcl—2蛋白的表达无差异(P>0.05)。 7、13-MTD对Jurkat细胞中C—myc蛋白表达的影响 Western blot分析显示C—myc在13-MTD诱导Jurkat细胞凋亡过程没有明显的变化(P>0.05)。 8、13-MTD对Jurkat细胞中凋亡信号蛋白pAKT蛋白表达的影响 在13-MTD处理的Jurkat细胞中，AKT的磷酸化水平显著降低(P<0.05)，而且与药物诱导细胞凋亡的时间同步。 9、13-MTD对Jurkat细胞中凋亡信号蛋白p NF—κB蛋白表达的影响 在13-MTD处理的Jurkat细胞中，13-MTD作用12-24小时后，NF—κ B的磷酸化水平明显降低(P<0.05)。 三、13-MTD对T—NHL的体内抗肿瘤作用 建立T细胞淋巴瘤EL4细胞荷瘤裸鼠移植瘤模型，随机分组为溶剂对照组和药物组，每组6只，具体分组如下：①Control组：溶剂对照组，每天灌胃，连续15天；②药物组：13-MTD70mg/kg/d，每天灌胃，连续15天。检测肿瘤体积变化和瘤重，计算抑瘤率。实验结果为，药物组较对照组肿瘤生长速度明显减慢，从第5天起肿瘤体积较对照组明显缩小，药物组抑瘤率为40％。用药后各组裸鼠的平均体重在实验过程中无明显差别(P>0.05)。各组裸鼠均未出现实验终止前提早死亡的情况及明显毒副作用。 结论： 1.饱和脂肪酸13-MTD对多种T—NHL细胞均有良好的抗肿瘤增殖作用；而且诱导多种T—NHL细胞凋亡，具有时间依赖性和浓度依赖性。 2.13-MTD诱导T—NHL细胞凋亡的发生是通过线粒体应激途径参与的、激活Caspase细胞内信号通道，在13-MTD诱导T—NHL细胞株凋亡的过程中存活信号通路PI3K/AKT及NFκB活性下调。 3.13-MTD对T—NHL荷瘤裸鼠移植瘤具有良好的抗肿瘤作用。