本学位论文以橘园重要害虫褐色橘蚜Aphis(Toxoptera)citricidus(Kirkaldy)为研究对象,基于其转录组数据,利用生物信息学分析方法筛选得到2条乙酰胆碱酯酶基因序列,结合实时荧光定量PCR技术解析这2个基因在褐色橘蚜不同体段及不同发育阶段的表达模式;最后,分别利用RNAi技术以及真核表达技术从基因沉默及过表达两个方面深入解析这2个乙酰胆碱酯酶基因的分子特性和功能,以期为研究褐色橘蚜抗性发生的分子机理提供基础数据。主要研究结果如下:1褐色橘蚜乙酰胆碱酯酶Tcace1和Tcace2基因序列及系统发育分析基于本课题组测序获得的褐色橘蚜转录组数据,利用生物信息学分析方法,鉴定得到与昆虫乙酰胆碱酯酶同源的2条乙酰胆碱酯酶基因的序列信息。利用PCR技术克隆获得了褐色橘蚜Tcace1(KP723526)和Tcace2(KP723527)的cDNA全长序列。功能区域预测分析发现由这2条基因序列编码的蛋白质为乙酰胆碱酯酶(AChE,EC3.1.1.7),均具备包括酰基口袋、催化三联体、氧离子洞、胆碱结合位点、形成三个分子内二硫键的6个半胱氨酸残基和许多芳香族残基在内的乙酰胆碱酯酶典型的保守结构域,表明其具有乙酰胆碱酯酶保守位点,并可能有催化水解活性。通过推导的氨基酸序列的系统发育分析,发现TcAChE1和TcAChE2分属两支。此外,这2个乙酰胆碱酯酶与豌豆长管蚜Acyrthosiphon pisum及棉蚜Aphis gossypii乙酰胆碱酯酶同源性最高。2褐色橘蚜Tcace1和Tcace2基因时空表达模式分析采用实时荧光定量PCR技术对Tcace1和Tcace2在褐色橘蚜不同发育阶段及不同体段的表达特性进行分析。结果显示,Tcace1和Tcace2在褐色橘蚜的若虫期以及成虫期均有表达,表达量从若虫期到成虫期呈现逐渐上升的趋势,且在无翅成蚜的表达量高于有翅成蚜;两基因在褐色橘蚜头、胸、腹皆有表达,且在头部高表达。3基于RNAi技术的褐色橘蚜Tcace1和Tcace2基因的功能鉴定使用设计的饲喂装置通过饲喂法将Tcace1和Tcace2的dsRNA液导入褐色橘蚜体内,利用qPCR技术检测褐色橘蚜取食dsRNA不同时间后的沉默效率,发现在48 h后目的基因的沉默效果明显,Tcace1和Tcace2的沉默效率分别达到55%和50%,且不存在相互干扰及脱靶效应,沉默效率与对照相比存在显著差异(P<0.05)。且在48 h内,干扰Tcace1基因后褐色橘蚜的死亡率显著上升。使用LC10-LC20的马拉硫磷及西维因分别处理饲喂dsRNA 48 h后的褐色橘蚜24 h,结果发现处理组试虫对药剂的敏感性显著上升(P<0.05)。其中,马拉硫磷处理Tcace1干扰后的试虫死亡率达到74%,处理Tcace2干扰的试虫死亡率为52%,且二者存在显著差异(P<0.05);西维因处理Tcace1干扰后的试虫的死亡率达到84%,处理Tcace2干扰的试虫死亡率为59%,且二者存在显著差异(P<0.05)。进一步检测饲喂2个基因的dsRNA 48 h后存活褐色橘蚜的乙酰胆碱酯酶活性发现,发现其活性均发生了显著变化(P<0.05):与对照相比,干扰Tcace1后其活性为61%,干扰Tcace2后其活性为73%。综上结果表明,Tcace1和Tcace2在褐色橘蚜对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂敏感性中可能具有重要作用,且Tcace1较Tcace2发挥的作用更大。4褐色橘蚜Tcace1和Tcace2基因异源表达及活性分析采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,在昆虫细胞Sf9中表达出褐色橘蚜Tcace1和Tcace2的重组蛋白。以乙酰胆碱酯酶的3种典型底物乙酰硫代胆碱碘化物acetylthiocholine iodide(ATCHI)、丁酰硫代胆碱碘化物butyrylthiocholine iodide(BTCHI)及丙炔基硫代胆碱碘化物propinylthiocholine iodide(PTCHI)对表达产物进行酶活性测定发现,表达TcAChE1和TcAChE2蛋白的Sf9细胞裂解液的酶活性显著增高,且对底物的亲和性更高,酶促反应速率更快,说明Tcace1和Tcace2在Sf9细胞中得到成功表达,且获得较高活性的可溶性蛋白。进一步统计分析发现,重组蛋白TcAChE1比TcAChE2对底物更具亲和性。比较分析重组蛋白对10种抑制剂的双分子速率常数发现,抑制剂对TcAChE1的双分子速率大于TcAChE2,也即TcAChE1对抑制剂更加敏感。这些结果证实TcAChE1和TcAChE2在褐色橘蚜神经突触内水解乙酰胆碱的重要生理功能,更为重要的是进一步说明TcAChE1是褐色橘蚜介导杀虫剂不敏感性的主要形式。综上所述,本学位论文研究综合利用生化毒理学、生物信息学和分子生物学等学科知识和技术手段从褐色橘蚜鉴定出介导其神经冲动及在对杀虫剂不敏感性中起重要作用的2个乙酰胆碱酯酶基因,全面解析了这2个乙酰胆碱酯酶基因的序列特征、系统进化关系、时空表达模式,并且综合运用RNAi扰和真核表达两种方法,分别从基因沉默和基因过表达两个层面对它们的功能进行了分析。研究结果为深度挖掘乙酰胆碱酯酶基因在昆虫体内的重要生理功能奠定了基础。