论文部分内容阅读
目的：检测微小RNA-21（miR-21）在慢性溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）及结肠癌（colon cancer）组织中的表达水平，明确miR-21基因敲除（miRNA-21knockout, miR-21KO）小鼠与对照鼠（wild type,WT）对肠道损伤与结肠肿瘤诱导的差异反应，探讨miR-21调控肠道屏障功能与炎症相关性结肠癌（colitis-associated colon cancer,CAC）的作用机制。方法：（1）利用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerasechain reaction，qRT-PCR）技术，检测UC患者、结肠癌患者结肠组织病理标本与对照的正常结肠粘膜组织中miR-21的表达水平；利用蛋白质印迹（Western Blot）及免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术检测miR-21KO小鼠与对照WT组小鼠炎症相关性结肠肿瘤组织中调控炎症与肿瘤发生发展的细胞信号通路关键分子及炎症性肿瘤的相关指标分子的表达水平。应用酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测结肠癌患者血清与小鼠血清及小鼠结肠损伤组织培养上清中各种炎症及肿瘤相关因子的含量，应用线性回归法统计37例结肠癌患者肿瘤组织中miR-21的表达量与对应促肿瘤性炎性细胞因子mRNA（TNF-α、IL-6、IL-21）的表达量的相关性并计算肿瘤组织中miR-21的表达量与对应结肠癌患者血清中促肿瘤性炎性细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-17A）的蛋白含量的相关性。（2）利用miR-21flox/flox小鼠与E2α-Cre (Strain Name: B6.FVB-Tg (EIIa-cre) C5379L mgd/J, The Jackson Laboratory, USA)小鼠杂交构建miR-21KO小鼠模型。应用3.5%（w/v）葡聚糖硫酸钠（dextran sulfatesodium, DSS）诱导小鼠的肠道炎症损伤模型，应用氧化偶氮甲烷12.5mg/kg体重（azoxymethane,AOM）腹腔注射加2.0%DSS（w/v）经饮水途径摄入诱导小鼠的CAC模型。（3）应用荧光素异硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-Dextran)胃饲检测小鼠活体肠道通透性，评估肠道屏障功能。应用Ki-67染色及TUNEL检测结肠上皮细胞及肠道肿瘤组织中肿瘤细胞的增殖凋亡情况，评估肠道的屏障功能及肠道肿瘤的发生发展情况。（4）应用疾病活动指数（disease activity index, DAI）评分系统评估DSS及AOM/DSS诱导的肠道炎症损伤的miR-21KO小鼠及对照WT小鼠的疾病状态的差异。应用组织病理学评分系统评估DSS及AOM/DSS诱导的miR-21KO小鼠及对照WT小鼠肠道炎症与损伤的程度。检测肠道炎症损伤诱导小鼠的血液学指标（白细胞，红细胞，血细胞比容等）差异情况，测量小鼠结肠长度及重量以评估miR-21KO小鼠及对照WT小鼠对DSS及AOM/DSS诱导的肠道炎症损伤的易感程度，应用小鼠肠道肿瘤数量计数及肿瘤大小检测评估miR-21KO小鼠及对照WT小鼠对AOM/DSS诱导炎症相关性结肠肿瘤的易感情况。结果：（1）miR-21在炎症损伤性肠道组织及结肠肿瘤组织中的表达明显高于对照的正常肠道组织，结肠癌患者结肠肿瘤组织中miR-21的表达与对应促肿瘤性炎性细胞因子mRNA（TNF-α、IL-6、IL-21）的表达量呈明显的正相关，其与结肠癌患者血清中肿瘤相关性炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-17A）的含量也呈明显的正相关。（2）DSS诱导的miR-21KO小鼠肠道炎症损伤程度明显低于相同诱导情况下的对照组WT小鼠，经DSS诱导肠道炎症损伤后miR-21KO小鼠DAI评分明显低于对照组WT小鼠，肠道炎症损伤过程中血液学指标检测结果（血白细胞）明显好于对照组WT小鼠，活体肠道通透性增加幅度也明显低于对照组WT小鼠，死亡率明显降低，结肠长度及重量减少程度也明显小于对照组WT小鼠，血清及炎症损伤肠道组织培养上清中炎症因子含量升高幅度也明显低于对照组WT小鼠，肠上皮细胞凋亡率、组织学病理评分均明显低于对照组WT小鼠。（3）AOM/DSS诱导的miR-21KO小鼠炎症相关性结肠肿瘤成瘤数量明显低于相同诱导情况下的对照组WT小鼠，miR-21KO小鼠炎症相关性结肠肿瘤诱导过程中体重减轻程度明显小于对照组WT小鼠，整个AOM/DSS干预过程中DAI评分低于对照组WT小鼠，miR-21KO小鼠炎症相关性结肠肿瘤诱导的成瘤率、肿瘤数量及肿瘤大小均明显低于对照组WT小鼠，组织病理学评分、组织炎症因子与血清炎症因子含量、肿瘤细胞的增殖率均明显低于对照组WT小鼠，相关促肿瘤发生发展的基因及抑制肿瘤发生发展的基因的表达相对于对照组WT小鼠均显示出明显的差异表达，比如miR-21KO肠道肿瘤组织中较高的E-cadherin表达，较低的β-catenin、SOX-9表达，而炎症相关性肿瘤细胞信号通路活性相对于对照组WT小鼠均明显受到抑制，比如NF-κB-IL-6-STAT3炎症相关性肿瘤细胞信号通路活化程度明显低于对照组WT小鼠。此外miR-21KO结肠肿瘤细胞凋亡率明显高于对照组小鼠。结论：（1）miR-21在炎症损伤性肠道组织中呈明显的高表达，miR-21KO能明显改善DSS诱导的肠道炎症损伤性小鼠的生存时间，miR-21KO能够有效的减弱肠道炎症及组织损伤的发生。因此，在肠道组织中降低miR-21的表达可抑制炎症性肠病患者疾病的发生与发展。（2）肠道组织中miR-21的过表达能促进肠道炎症的发生，引发肠道免疫功能的紊乱，并在AOM/DSS诱导结肠炎症相关性肿瘤发生的情况下促进炎症相关性肿瘤的发生发展，因此，降低miR-21在肠粘膜中的表达能够有效的降低炎症性肠病患者罹患CAC的风险。