副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌或条件致病菌,1910年K.Glasser首先发现并报道该病原,该菌感染猪后可引发多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。近年来,由副猪嗜血杆菌所引起的革拉瑟氏病已成为影响养猪业发展的一种重要细菌性疾病。发病后及时采用抗生素进行治疗可显著降低动物死亡率,同时在生产过程中适当添加抗生素也可在一定程度上降低该病的发生率。但随着大量抗菌药特别是广谱抗菌药在养猪业中的广泛使用,细菌对抗菌药物的耐药性问题日趋突出,与此同时也有研究资料表明亚抑制浓度的抗生素可以影响细菌的代谢过程而改变细菌的毒力或细菌对环境的适应能力等。本研究围绕副猪嗜血杆菌对喹诺酮类药物的耐药机理、耐药质粒的分布情况及其与亚抑制浓度氟苯尼考相互作用进行研究,以了解副猪嗜血杆菌耐药情况、耐药机理及亚抑制浓度氟苯尼考对其转录谱的影响,为合理使用抗菌药物提供理论基础,主要研究内容、方法及结果如下：1.副猪嗜血杆菌耐喹诺酮类药物的机制研究副猪嗜血杆菌血清型众多,免疫预防往往因为疫苗交叉保护力低而致免疫失败,抗生素治疗便成为控制革拉瑟氏病的主要手段和措施。氟喹诺酮类药物因具有抗菌谱广、杀菌力强等优点而在养猪生产过程中得到广泛应用。研究表明细菌对喹诺酮类药产生耐药性主要通过编码旋转酶和拓扑异构酶的基因gyrA和parC发生突变而引起,同时也存在由质粒qnr及外排泵所介导的耐药。目前国外已围绕副猪嗜血杆菌的药物敏感性及耐药性等问题进行了大量研究,但国内的相关研究相对较少。本研究首先采用特异性16S rRNA PCR方法对临床分离株进行鉴定,确认分离株是副猪嗜血杆菌后测定菌株对萘啶酸、环丙沙星和恩诺沙星的敏感性,然后用特异性PCR扩增副猪嗜血杆菌标准菌株和MIC值较高的临床分离株的gyrA和parC基因的喹诺酮耐药决定区(QRDR)并进行测序。采用Blast法对测序结果进行分析,包括副猪嗜血杆菌标准血清型间的比对及耐药株与敏感株之间的比对。在测MIC的同时添加外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺以检测是否存在由外排泵介导的细菌对喹诺酮类药物的耐药性,同时还设计特异性引物以扩增质粒qnr以检测是否存在由质粒所介导的细菌对喹诺酮类药物的耐药性。研究结果表明,副猪嗜血杆菌标准血清型的QRDR序列间具有高度的保守性,未发现有差异基因。而耐药株的gyrA和parC的QRDR区域存在数量不等、位置各异的突变位点,其中GyrA以83位和87位的突变为主,发生突变的主要方式为ser-83-phe和ser-83-tyr,asp-87-asn、asp-87-gly和asp-87-tyr。而ParC以73位和77位为主；GyrA的突变在副猪嗜血杆菌耐喹诺酮类药物的机理中占主导作用,而ParC的突变仅起次要作用,往往发生于GyrA突变之后。在所用的临床分离株中未发现由质粒和外排泵所介导的细菌对喹诺酮类药物的耐药性。研究结果可以为制定副猪嗜血杆菌对喹诺酮类药物的敏感性判定标准提供理论依据。2.副猪嗜血杆菌耐药质粒的提取及功能分析常见的耐药因子达数百种之多,其中部分耐药因子可通过染色体突变产生并可以垂直传播,部分耐药因子由质粒等可移动元件所介导,能够水平传播。目前CLSI尚未确定各种抗菌药物对副猪嗜血杆菌耐药性的判定标准,因此不能仅仅依据各种药物对副猪嗜血杆菌的MIC值大小确定菌株是否耐药,若直接用PCR等方法去检测耐药因子则效率较低。本研究通过从副猪嗜血杆菌临床分离株提取耐药质粒,以了解副猪嗜血杆菌临床分离株耐药质粒的流行情况及可能的耐药情况。本研究用Qiagen公司质粒小提试剂盒对156株副猪嗜血杆菌临床分离株进行质粒提取,所获得的质粒先用合适的内切酶进行酶切,再与相应的载体连接后转化感受态细胞,挑阳性重组子进行测序、注释,进而获得质粒分离菌株的耐药情况。本研究仅在1株临床分离株(A67)中分离出质粒,其大小约为4.2kb。内切酶Sau3AI可以将所分离出的质粒进行有效切割,获得大小分别为2.7kb和1.5kb的片段,将小片段与经内切酶BamHI进行酶切后的pUC19载体进行连接,连接产物成功转化BL21感受态细胞,挑选阳性重组子送上海生工生物有限公司用M13正、反向引物对插入序列进行测序。再根据所测得的小片段的碱基序列设计引物,以所提质粒为模板进行测序,直至测通。用DNAstar软件对测序所获得的序列进行拼接并删除重复序列,得到一闭合环状的质粒DNA,其大小为4248bp,其中主要包含有mobA、mobB和mobC等移动因子和sul2及strA两种耐药因子,质粒序列已保存至GenBank(No. FJ670543)。对含有耐药质粒的菌株进行了链霉素和磺胺甲基异恶唑的药物敏感性试验,其MIC值大小分别为128和512μg/mL。所提取的质粒可以成功转化至多杀性巴氏杆菌,转化菌对上述两种药物也产生耐药性。研究结果表明,该质粒可以介导副猪嗜血杆菌对链霉素和磺胺类药物产生耐药性。3.亚抑制浓度氟苯尼考对副猪嗜血杆菌转录谱的影响研究不同浓度的抗生素对细菌会产生不同的作用,高浓度抗生素对细菌产生抑制或杀灭作用,而低浓度抗生素不但不能抑制或杀灭细菌,而且有可能作为一种信号物质对细菌的代谢过程进行调节,进而影响细菌的毒力和适应性等特性。本研究选用我国养猪生产中广泛使用的广谱抗生素——氟苯尼考作为研究对象,探讨亚抑制浓度氟苯尼考对副猪嗜血杆菌转录谱的影响。根据GenBank所公布的副猪嗜血杆菌SH0165株全序列(CP001321)设计探针,由Agilent公司进行芯片的设计与制作。将副猪嗜血杆菌临床分离株SH0165株分别于添加亚抑制浓度氟苯尼考(0.25μg/mL)和不添加药物的条件下培养16h,分别提取mRNA用于后续的芯片研究,每个处理组设3个生物学重复。以mRNA进行反转录获得cDNA及cRNA,并对cRNA进行荧光标记,点校进行检测而获得差异表达基因,用实时荧光定量PCR对差异表达基因进行验证。经亚抑制浓度氟苯尼考作用后,副猪嗜血杆菌的转录谱较对照组发生较明显的改变,共有163个基因表达水平变化在1.5倍(p<0.05)以上,其中96个基因表达上调,另外67个基因表达下调。表达上调的基因主要包括参与碳水化合物代谢、铁离子摄取与利用、潜在毒力因子神经氨酸酶等,这些基因的表达上调可以增强细菌对环境的适应能力,同时也可能改变菌株的潜在毒力。而作为主要抑制蛋白质合成的抗生素,亚抑制浓度氟苯尼考对蛋白质合成的相关基因的抑制作用却很轻微。本研究结果表明,临床上使用低剂量抗生素预防呼吸道细菌性感染时有必要考虑药物对细菌生理生化活动的影响,特别是要注意在抗生素的作用下细菌的毒力及适应性方面的改变。