论文部分内容阅读
研究背景：结核病是严重危害人类健康的疾病之一，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）是结核病的病原体；M.tb可隐藏于宿主巨噬细胞内，通过干扰巨噬细胞吞噬和溶酶体成熟等机制，逃逸免疫系统的识别和杀伤。近年来，自噬（autophagy）在抗结核免疫中的作用受到广泛的关注。许多的研究资料显示：自噬信号的缺乏和抑制是M.tb逃逸巨噬细胞免疫识别和杀伤的关键因素之一。有研究表明，LPS参与诱导的自噬能克服吞噬体溶酶体成熟障碍，并促进M.tb与自噬体共区域化，进而通过自噬溶酶体途径促进巨噬细胞内M.tb的清除。有研究发现，IFN-γ及Th1/Th2细胞因子向Th1的极化等均可促进人巨噬细胞对病原体的自噬。进一步阐明LPS对巨噬细胞抗结核自噬和细胞因子的影响，对于研究LPS作为可能的抗结核药物或免疫佐剂具有重要的临床实际价值。目的：研究LPS对巨噬细胞抗结核自噬和细胞因子的影响。方法：1.结核分枝杆菌减毒株M.tb（H37Ra）用苏通氏液体培养基于细菌培养箱中培养1个月后接种至罗琴氏固体培养基，37°C培养1个月，无菌接种环收集M.tb菌体于1ml匀浆器中，加入生理盐水反复研磨，取细菌悬液，用生理盐水经10000rpm×2min洗涤3次，抗酸染色阳性且镜下观察细菌分散。分光光度计检测菌液浓度，用生理盐水配成浓度为5×106/ml的M.tb悬液，4°C备用。2.透射电镜观察LPS（100ng/ml）对感染M.tb的THP-1巨噬细胞自噬的影响。3.荧光定量PCR检测LPS（100ng/ml）对感染M.tb前后THP-1(A)细胞内IL-12p35和IL-12p40基因表达水平，ELISA检测LPS对THP-1(A)细胞IL-12P70蛋白分泌的影响，Western blot检测THP-1(A)细胞自噬相关蛋白LC3-II蛋白表达水平。4.以特异性阻断剂三甲基嘌呤3-MA（3-Methyladenine)阻断自噬，荧光定量PCR和ELISA检测LPS（100ng/ml）对THP-1来源巨噬细胞IL-12表达的影响。5.健康人和结核病患者各5例，取外周抗凝血，加入佛波醇酯（PMA）和钙离霉素（Ionomycin）刺激2小时后，加入莫能霉素（Monensin）继续培养4小时，收集细胞，加入荧光标记抗体anti-CD3-APC，anti-CD8-PECY5.5染色，透膜后再加细胞因子荧光标记单抗anti-IFN-γ和anti-IL-4进行细胞内染色，流式细胞仪检测分泌IFN-γ和IL-4的T细胞亚群的比例。6.健康人和结核病患者各5例，取外周抗凝血各4ml，分离获得外周血单个核细胞（PBMC），用含5%NBS RPMI-1640培养液配成细胞悬液，浓度为1.5×106ml，接种于24孔培养板，于结核病人孔加入100ng/ml LPS，培养24h后，流式细胞仪检测分泌IFN-γ和IL-4的T细胞亚群的比例。结果：1.透射电镜观察100ng/ml的LPS能够促进M.tb感染的THP-1巨噬细胞产生自噬。2Western blot结果显示LPS可显著上调M.tb感染的THP-1巨噬细胞自噬相关蛋白LC3-II表达水平。3.荧光定量PCR检测结果显示，LPS可显著上调M.tb感染的THP-1巨噬细胞IL-12p35和IL-12p40基因表达水平，自噬特异性阻断剂3-MA（5Mm）预处理可显著抑制这一效应(p<0.05)。4. ELISA结果显示，M.tb感染THP-1来源巨噬细胞上清液中IL-12p70蛋白含量（28.63±5.78）与未感染组（25.03±4.32）相比，差异无显著性（p>0.05）；M.tb感染THP-1来源巨噬细胞，经LPS刺激, IL-12p70蛋白含量(291.23±25.75)较未刺激组（28.63±5.78)明显升高，差异有统计学意义（p<0.05），自噬特异性阻断剂3-MA（5Mm）可显著抑制上述效应（p<0.05）。5.健康人外周血T细胞中IFN-γ表达水平(11.45±4.10)%， IL-4表达水平(0.92±0.98)%，与结核病患者组(5.11±1.17)%及(1.66±0.34)%比较，差异有统计学意义（p<0.05）。6.100ng/ml LPS刺激组结核病患者外周血T细胞IFN-γ表达水平(8.43±1.39)%明显高于未处理组(6.12±1.65)%，差异有统计学意义（p<0.05）；刺激组IL-4表达水平(1.43±0.44)%与未处理组(2.03±0.66)%比较，差异无统计学意义(p>0.05)。结论：1. LPS能够上调结核病患者外周血受抑制的Th1型细胞因子的表达；2. LPS对巨噬细胞抗结核自噬和细胞因子表达水平有显著促进作用；3. LPS可能通过促进巨噬细胞自噬水平，上调抗结核细胞因子IL-12的表达。