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背景:肺癌是目前造成死亡率最高的癌症之一,其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌病例的85%。肺癌的发病率在世界上的一些地区已经逐渐达到高峰,但在世界上许多其他地区,特别是中国,肺癌的发病率仍在逐年上升。目前NSCLC的诱因尚不完全清楚,有研究表明吸烟是导致肺癌最重要的因素,但是随着大多数西方国家吸烟率的下降,NSCLC在患者中仍占有主导地位,其诱因可能是环境、情绪、遗传等多方面因素共同作用的结果。依据目前的治疗方法,NSCLC患者并不能完全治愈,多数患者会出现复发或者出现转移。NSCLC的治疗方式包括早期手术、局部晚期肿瘤的同步放化疗、靶向治疗和转移性疾病的姑息性化疗等。肿瘤治疗学的一个重要发现是NSCLC中表皮生长因子磷酸激酶(EGFR TK)结构域的体细胞突变及其与表皮生长因子磷酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)反应的相关性。EGFR基因扩增在东方人群中更为普遍,而与之密切相关的人表皮生长因子受体-2(HER2)基因扩增在东亚患者中更为常见,这也可能对NSCLC的治疗产生影响。抗血管生成药物和EGFR-TKI的引入提高了NSCLC患者的应答率。但是随着治疗时间的延长,患者会对一些药物出现耐药现象,尤其是对EGFR-TKI的耐药。所以探索NSCLC患者的耐药机制迫在眉睫,有利于新的治疗方法提高患者的生活质量。非编码RNA(Lnc RNA)与微小RNA(Micro-RNA)在肺癌的发生、发展及对靶向药物的获得性耐药方面均具有调控作用,因此,我们从LncRNA入手,探究了新型Lnc RNA RHPN1-AS1靶向的Micro-RNA,并进一步深入研究了该LncRNA在NSCLC吉非替尼获得性耐药中所发挥的作用及相关机制。目的:1、探究RHPN1-AS1在对吉非替尼耐药的患者和NSCLC细胞中的表达情况;2、探究RHPN1-AS1调控NSCLC对吉非替尼耐药性的耐药机制方法:1、收集EGFR突变的NSCLC患者肿瘤组织,通过RT-qPCR技术检测耐药组织和敏感组织中RHPN1-AS1的表达水平。2、体外培养人肺腺癌细胞系(PC-9)和人NSCLC细胞系(HCC-827),两种细胞经RHPN1-AS1敲减和过表达处理,CCK-8实验测定RHPN1-AS1对两种细胞系的吉非替尼响应的影响。3、RHPN1-AS1敲减和过表达处理吉非替尼诱导的PC-9和HCC827细胞,Annexin V/PI染色,FACS分析检测细胞凋亡水平;Transwell结晶紫染色,显微镜下观察RHPN1-AS1对吉非替尼处理的上述两类细胞的侵袭的影响。4、通过建立裸鼠成瘤实验检测过表达RHPN1-AS1后是否可以影响肿瘤在体内的生长。我们使用LV-RHPN1-AS1和LV-NC构建稳定过表达RHPN1-AS1的NSCLC-PC9-GR细胞和对照组细胞,皮下注射入裸鼠,30天后测量肿瘤大小。5、生物信息学预测RHPN1-AS1的作用miRNA,采用免疫共沉淀RNA、实时定量和荧光素报告基因法确证RHPN1-AS1对MiR-299-3p的表达影响以及直接相互作用和位点。并在患者水平验证组织中MiR-299-3p表达水平。6、生物信息学预测MiR-299-3p结合的靶基因mRNA,并模拟其与MiR-299-3p的结合位点,采用实时定量法在组织和细胞水平验证靶基因TNFSF12的表达。7、采用荧光素酶报告基因法验证MiR-299-3p与靶基因TNFSF12的结合以及结合位点;用实时定量PCR和WB法分别在RNA和蛋白水平验证MiR-299-3p对结合靶基因TNFSF12表达的影响。8、采用回补实验分别从分子和细胞水平,验证RHPN1-AS1参与调控的信号通路;并检测了该通路对细胞增殖、凋亡和侵袭功能的影响。结果:1、应用吉非替尼治疗的患者肿瘤组织标本进行了组织中表达水平的检测显示:吉非替尼耐药组中RHPN1-AS1的表达明显低于吉非替尼敏感组,随着RHPN1-AS1的表达增高吉非替尼的耐药性下调,代表吉非替尼的IC50与pcDNARHPN1-AS1量呈负相关。2、用小干扰RNA的转染吉非替尼敏感细胞来抑制RHPN1-AS1的表达,构建RHPN1-AS1低表达细胞系,发现可以提高吉非替尼处理的细胞增殖能力,降低了细胞凋亡的细胞的数量,导致吉非替尼刺激下细胞移动性增加,说明NSCLC对吉非替尼耐药性需要RHPN1-AS1的存在。3、构建RHPN1-AS1过表达细胞系并用实时定量PCR检测了RHPN1-AS1的过表达转染效率,结果显示过表达RHPN1-AS1的耐药NSCLC细胞对吉非替尼的IC50左移,在吉非替尼处理下的细胞凋亡比例增多,侵袭迁移能力下降,说明过表达RHPN1-AS1赋予NSCLC细胞耐药株对吉非替尼的敏感性。4、使用Starbase预测可结合miRNA,并采用了生物素亲和素下拉实验验证了MiR-299-3p对RHPN1-AS1的识别,采用荧光素酶报告基因测定,我们发现只有RHPN1-AS1-WT可以与MiR-299-3p结合。说明MiR-299-3p可以与RHPN1-AS1直接结合。5、使用Targetscan进行靶标预测。预测结果显示TNFSF12可能为MiR-299-3p的靶点,然后采用荧光素酶报告基因验证MiR-299-3p可以与TNFSF12直接结合,并用实时定量PCR和WB法验证Mi R-299-3p可以影响TNFSF12的表达,证实了预测结果的真实性。6、通过转染、CCK8、流式和Transwell实验检测细胞增殖、凋亡和迁移水平,结果显示TNFSF12可以部分逆转细胞对吉非替尼的药物敏感性,说明RHPN1-AS1通过靶向MiR-299-3p/TNFSF12通路调控吉非替尼耐药株的耐药机制。结论:在这项研究中,我们首先采用实时定量PCR对44例吉非替尼敏感和40例吉非替尼耐药的患者肿瘤组织标本进行了组织中表达水平的检测,结果显示在吉非替尼耐药组中RHPN1-AS1的表达明显低于吉非替尼敏感组。为了进一步确认,我们又在PC9细胞系上转染不同量的pcDNA-RHPN1-AS1,结果发现随着RHPN1-AS1的表达增高,吉非替尼的耐药性下调。接下来,转染一个小干扰RNA来抑制RHPN1-AS1的表达,然后检测沉默RHPN1-AS1后两株细胞的耐药性。与对照组相比,下调RHPN1-AS1表达可提高吉非替尼敏感株的耐药性,这些数据表明,NSCLC细胞对吉非替尼耐药需要RHPN1-AS1的存在。我们在吉非替尼耐药的NSCLC细胞中构建RHPN1-AS1过表达细胞系,检测了过表达RHPN1-AS1的耐药株对吉非替尼的耐药性,结果显示过表达RHPN1-AS1赋予NSCLC细胞耐药株对吉非替尼的敏感性。我们使用Starbase v.2.0来预测与RHPN1-AS1直接相互作用的潜在miRNA,发现MiR-299-3p和MiR-7-5p是最可能的靶点。为了进一步验证MiR-299-3p与RHPN1-AS1的结合,我们突变RHPN1-as1的序列,并采用双荧光素酶报告基因测定,发现只有RHPN1-AS1-WT可以与MiR-299-3p结合。采用qRT-PCR检测NSCLC患者中MiR-299-3p的表达,与敏感的吉非替尼NSCLC患者相比,显示对吉非替尼耐药的NSCLC患者中MiR-299-3p表达上调。总之,从我们的研究结果中证实,RHPN1-AS1对MiR-299-3p表达有抑制作用,并直接作为海绵作用于MiR-299-3p。我们应用实时定量PCR检测了TNFSF12在NSCLC组织和细胞系中的表达。结果表明,在吉非替尼耐药患者组织中TNFSF12的表达较吉非替尼敏感的患者中明显降低。然后,进行了荧光素酶报告基因检测,提示TNFSF12是MiR-299-3p的直接靶点。后续实验证明:RHPN1-AS1通过靶向Mi R-299-3p/TNFSF12通路调控吉非替尼耐药株的耐药机制。